反溶劑_高壓均質(zhì)法制備羥基喜樹堿納米粒工藝及其性質(zhì)研究

1、（生物資源生態(tài)利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，東北林業(yè)大學(xué)林業(yè)生物制劑教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150040）摘要 為了減小羥基喜樹堿的粒徑，該研究首先采用了反溶劑法（以二甲基甲酰胺，三氯甲烷為反溶劑）對羥基喜樹堿原粉微粉化，使其粒徑降低至 1 000 nm 以下，再通過高壓均質(zhì)法將羥基喜樹堿微粉納米化。在反溶劑過程中，考察了多種溶劑及反溶劑，確定了以二甲基 甲酰胺為溶劑，三氯甲烷為反溶劑；在高壓均質(zhì)過程中，考察了藥物濃度、均質(zhì)壓力及均質(zhì)循環(huán)數(shù)，最終確定了制備羥基喜樹堿納米粒的最 優(yōu)條件為：藥物濃度為 0.8 mg/mL，均質(zhì)壓力為 60 MPa

2、，均質(zhì)循環(huán)數(shù)為 20 個循環(huán)。以上條件制備的羥基喜樹堿納米粒粒徑為 135.1 nm；通過 激光粒度分析儀及 X 射線衍射（XRD）對羥基喜樹堿原粉與納米粒進行了性質(zhì)分析，與原粉相比羥基喜樹堿納米粒的粒徑及結(jié)晶度均有所 降低。關(guān)鍵詞 羥基喜樹堿；反溶劑法；高壓均質(zhì)；納米粒中圖分類號 R944.9文獻標識碼 A文章編號 1007-5739（2013）08-0138-02Preparation and Characterization of Nanoparticle of Hydroxycamptothecin by Anti-solvent HighPressure Homogenization

3、 MethodSUN Bai-he WANG Zhi-chao ZHAO Xiu-hua LI Qing-yong *（State Engineering Laboratory of Bio-Resources Eco-Utilization；Key Laboratory of Forest Plant Ecology，Northeast Forestry University，Ministry ofEducation；Engineering Research Center of Forest Bio-preparation，Ministry of Education，Northeast Fo

4、restry University，Harbin Heilongjiang 150040） AbstractTo decrease the particle size of hydroxycamptothecin，the nanoparticle of hydroxycamptothecin in an antisolvent process （using dimethylformamide as solvent and chloroform as atsolvent）and a high pressure homogenization technique was studied in the

5、 research.In antisolvent process，we inspected multiple solvents and antisolvents，then chose dimethylformamide and chloroform. In the high pressure homogenization process， drug concentration，pressure and the number of cycles were investigated. And we prepared the nano hydroxycamptothecin with the par

6、ticle size of 135.1 nm under the optimal condition（drug concentration 0.8 mg/mL，60 MPa and 20 cycles）. To detect the characterization of raw hydroxycamptothecin and nano hydroxycamptothecin ， we adopted laser particle analyzer and differential scanning calorimetry （ DSC ） . The particle size and cry

7、stallinity of nanohydroxycamptothecin decreased greatly compared with raw hydroxycamptothecin.Key words hydroxycamptothecin；anti-solvent method；high pressure homogenization technique；nanoparticle羥 基 喜 樹 堿 （hydroxycamptothecin，HCPT， 別 名 羥 基 樹堿、10-羥基喜樹堿）是從中國珙桐科植物喜樹中提取出來的 一種天然生物堿，屬天然抗腫瘤藥物1-2。羥基喜樹堿的分子 式

8、為 C20H16N2O5， 分子結(jié) 構(gòu)如 圖 1 所 示 。 羥基喜樹堿為 細胞 周期特異性藥物，DNA 拓撲異構(gòu)酶（topoisomerase ）是其 主要作用靶點，具有較強抗腫瘤作用和較寬的抗癌譜，對肝 癌、肺癌、卵巢癌及乳腺癌等有良好的療效3-8。O研究者研究了多種羥基喜樹堿的新劑型 ，如乳劑、 納米粒 、凍干粉針、固體分散物、滴丸、自微乳和脂質(zhì)體等14-16。而其 中多種新劑型都需要將羥基喜樹堿納米化。該研究利用反 溶劑法及高壓均質(zhì)技術(shù)，制備了粒徑均一、性質(zhì)穩(wěn)定 、 結(jié)晶 度較低的羥基喜樹堿納米粒，為以后羥基喜樹堿劑型的進 一步研究提供了良好的條件。1 材料與方法1.1 試驗材料與儀器

9、試驗材料：羥基喜樹堿（浙江海正藥業(yè)有限公司）、二甲 基甲酰胺（Sigma 公司），其他試劑為國產(chǎn)分析純或色譜純 。 試驗儀器：美國布魯克海文公司 Zeta 電位及激光粒度分析 儀、美國 FEI 公司掃描電鏡，日本島津 X 射線衍射儀、美國 Niecolet 公司傅里葉紅外光譜儀（FT-IR）等。1.2 試驗方法ONOOHN羥基喜樹堿微粉的制備 。 為了將植物藥羥基喜樹堿1.2.1OH原藥制備成羥基喜樹堿微粉，該文首先利用了反溶劑方法，在常溫下以二甲基甲酰胺為溶劑，三氯甲烷為反溶劑，制備 羥基喜樹堿微粉。取 60 mg 羥基喜樹堿原粉溶解于 1 mL 二 甲 基 甲 酰 胺 中 ， 充 分 溶

10、解 后 ， 在 攪 拌 條 件 下 ， 向 溶 液 中 逐 滴加入 2.5 mL 三氯甲烷，30 min 后將混合液體離心（10 000 r/min，10 min），棄上清液。利用二氧化碳超臨界萃取技術(shù)除 去離心后得到的沉淀中殘留的二甲基甲酰胺及三氯甲烷 。 處理后得到的粉末即為羥基喜樹堿微粉。1.2.2 納米羥基喜樹堿的制備 。 為了將羥基喜樹堿微粉納圖 1羥基喜樹堿的分子結(jié)構(gòu)但由于其特殊的理化性 質(zhì) 在水和脂質(zhì)中溶解度 均 較低，限制了其在臨床上的應(yīng)用9-11。早期使用于臨床上的羥基 喜樹堿制劑，是通過內(nèi)酯環(huán)開環(huán)使其形成可溶于水的鈉鹽 而達到臨床目的，該羥基喜樹堿鈉鹽制劑因其活性內(nèi)酯環(huán) 的

11、開環(huán)，使羥基喜樹堿的抗癌活性大大降低12-13。為解決羥 基喜樹堿由于其特殊的理化性質(zhì)帶來的臨床限制 ， 國內(nèi)外基金項目 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資助項目（DL12EA01）。* 通訊作者孫佰賀等：反溶劑 高壓均質(zhì)法制備羥基喜樹堿納米粒工藝及其性質(zhì)研究水中，再利用高壓均質(zhì)機將羥基喜樹堿納米化。在優(yōu)化反應(yīng)條件的過程中，選取了藥物濃度、均質(zhì)壓力及均質(zhì)循環(huán)數(shù) 3 個條件進行優(yōu)化，通過檢測不同均質(zhì)條件下所制備的羥基 喜樹堿納米粒的粒度來確定最優(yōu)反應(yīng)條件。最后，將均質(zhì)后 得到的液體進行冷凍干燥 ， 得到的粉末在 4 干燥的條件下保存。1.3 納米羥基喜樹堿的性質(zhì)分析1.3.1 粒度檢測。對得到的凍干粉

12、進行粒徑及其分布檢測。 取凍干后的羥基喜樹堿納米粒粉末分散于適量的去離子水 中，調(diào)節(jié)至適當(dāng)?shù)臐舛龋眉す饬６葍x分別檢測其粒徑及 其分布，每次掃描 1.5 min，每個樣品重復(fù) 3 次。1.3.2 結(jié)晶度分析。利用 X 射線衍射分析儀 （XRD） 分別檢測羥基喜樹堿原粉及其納米粒的結(jié)晶度 。X 射線衍射分析 儀檢測條件：掃描角度為 2 ，掃描速度為 5 /min， 掃描范 圍為 580 之間電壓 50 kV，電流 30 mA。1.3.3 紅外光譜 （FT-IR） 檢測 。 分別取 2 mg 羥 基喜 樹 堿 原 粉及納米粒 ， 再分別將其與 200 mg 的 KBr 混合 ， 在紅外干 燥箱中

13、烘干 15 min，將混合物研磨混合后壓片，在 4004 000 cm-1 范圍內(nèi)進行紅外掃描，對比 2 種樣品的結(jié)構(gòu)。2 結(jié)果與分析2.1 羥基喜樹堿納米粒的制備工藝在羥基喜樹堿微粉制備過程中，分別考察了乙醇、乙酸 乙酯、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、三氯甲烷與水等多種溶 劑與反溶劑，最終得到最優(yōu)的反溶劑條件，以二甲基甲酰胺 與三氯甲烷的反溶劑體系。在高壓均質(zhì)反應(yīng)中，經(jīng)優(yōu)化試驗 得到的最優(yōu)條件為：均質(zhì)壓力 60 MPa，羥基喜樹堿濃度 0.8 mg/mL，均質(zhì) 20 個循環(huán)。2.2 粒徑及其分布經(jīng)激光粒度儀檢測發(fā)現(xiàn)，最終經(jīng)冷凍干燥得到的羥基 喜樹堿納米粒的平均粒徑為 135.1 nm， 分布范圍

14、為 109.6166.0 nm，如圖 2 所示。得到的納米粒的粒徑較以往文獻中報道的小，而且粒徑分布范圍較窄。12 000a9 0006 0003 00000306090212 000b9 0006 0003 000003060902羥基喜樹堿原粉及羥基喜樹堿納米粒 的 X 射線分析結(jié)果圖 3注：a 羥基喜樹堿原粉；b 羥基喜樹堿納米粒。2.4 紅外光譜（FT-IR）分析羥基喜樹堿原粉與其納米粒的紅外分析結(jié)果如圖 4 所 示?？梢钥闯觯u基喜樹堿納米粒的特征吸收峰的位置及峰 值與其原粉相比并無明顯變化 ，由此說明羥基喜樹堿納米 粒的化學(xué)結(jié)構(gòu)與其原粉相比并無變化 ，納米化過程并未改 變羥基喜樹堿

15、的化學(xué)結(jié)構(gòu)。原藥納米粒80706050403020100100500 1 000 1 500 2 0002 500 3 000 3 500 4 000波數(shù)cm-1圖 4 羥基喜樹堿原藥及納米粒的紅外分析結(jié)果3 結(jié)論與討論羥基喜樹堿是從喜樹中提取出來的一種天然生物堿 ， 是一種廣譜抗癌藥，但其特殊的理化性質(zhì)制約了其在臨床 上的廣泛應(yīng)用。因此，國內(nèi)外學(xué)者研究并改進了多種羥基喜 樹堿的新劑型。其中，部分劑型是通過低粒度的羥基喜樹堿 來制備的，因此羥基喜樹堿的納米化成為改進其新機型的 重要條件。該 文利用反溶劑法及高 壓 均質(zhì)技術(shù)成功制備了羥基 喜樹堿納米粒，紅外檢測結(jié)果顯示，納米化前后羥基喜樹堿 化

16、學(xué)結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯的改變。檢測結(jié)果表明，利用本方法 得到的羥基喜樹堿納米粒具 有 較小的粒徑及粒徑分 布 范 圍，并且多處于較低的結(jié)晶化程度 。因此，該羥基喜樹堿的 納米化方法將為以后羥基喜樹堿新劑型的研究提供有利的 條件。（下轉(zhuǎn)第 142 頁）139806040200105120135粒徑nm150165圖 2 羥基喜樹堿納米粒的粒徑分布2.3 X 射線衍射分析羥基喜樹堿原粉及納米羥基喜樹堿粉末的 X 射線衍射 檢 測 結(jié) 果 如 圖 3 所 示 。 可以 看 出 ， 羥基喜樹堿原粉在 2 =9.9、18.7、20.1處存在特征吸收峰 ， 而納米羥基喜樹堿僅 在 2 =9.9 處存在特征吸收

17、峰，而且峰值較羥基喜樹堿原藥 小?？梢哉f明，納米羥基喜樹堿結(jié)晶化程度較原粉低。強度強度強度透光率%林業(yè)科學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2013 年第 8 期少，且方式單一，除常見的采摘外，沒有其他較有特色的農(nóng)事體驗活動來滿足游客的不同需求。3.2 植物景觀存在的問題3.2.1 植物景觀粗糙，缺乏管理 。 在調(diào)查中發(fā)現(xiàn) ，大多數(shù)游 客不滿意婁底市休閑農(nóng)業(yè)園的的植物景觀現(xiàn)狀 ，主要是園 區(qū)的植物景觀模式較為單一，不同園區(qū)的植物景觀大同小 異，沒有形成較好的景觀效果。俗話說：“三分栽，七分管 ”， 園區(qū)中栽植的植物，不僅要使其成活，更重要的是要通過精 心的養(yǎng)護管理充分發(fā)揮其觀賞特性 ，讓游客最大限度地欣 賞植物景

18、觀帶來的美。據(jù)調(diào)查，婁底市休閑農(nóng)業(yè)園普遍存在 對植物管理粗放，甚至缺乏維護管理的現(xiàn)象。如新天地生態(tài) 農(nóng)莊，園區(qū)中很多大喬木枝葉稀疏，長勢較差；有很多灌木 雖有過整形，但因沒有及時修剪，影響了整體效果；地被植 物 雜 草 叢 生 ， 部分 枯 黃 、 枯 死 ， 缺 乏 美 感 ； 部分 綠 地 泥 土 裸 露，沒有種植地被植物。順鑫生態(tài)農(nóng)莊和三友農(nóng)莊的駁岸簡 單硬化，沒有栽植水生植物，造成駁岸線條僵硬，景觀效果 大打折扣；順鑫生態(tài)農(nóng)莊的燒烤臺周邊雜草叢生，缺乏必要 的植物配置和管理。3.2.2 植物景觀較缺乏地域文化內(nèi)涵 ，植物應(yīng)用種類不豐 富。地域文化是一定地域的人們在長期歷史發(fā)展過程中通

19、過體力和腦力勞動創(chuàng)造的，并不斷得以積淀、發(fā)展和升華的 物質(zhì)和精神的全部成果與成就 ，地區(qū)性是地域文化最鮮明 的特征6。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，15 家休閑農(nóng)業(yè)園在營造具有地域文化 的植物景觀上還有很大的不足 ，這與游客對植物景觀地域 特色的強烈需求形成鮮明的對比 。園區(qū)現(xiàn)有的植物景觀只 重視簡單的形式美，在植物景觀文化性的表達上還考慮得不夠深入。主要表現(xiàn)在鄉(xiāng)土植物種類應(yīng)用過少，對于大量具有開發(fā)價值的鄉(xiāng)土果樹、蔬菜與藥用植物、作物、觀賞植物 都缺乏應(yīng)用。另外，色葉樹種應(yīng)用較少，造成植物色彩搭配 單調(diào)，不能滿足游客的需求。3.2.3 與植物有關(guān)的體驗性活動種類較少 。 與植物有關(guān)的 體驗活動可以說是休閑農(nóng)業(yè)

20、園重要的組成部分 ，可在一定 程度上調(diào)動游客參與的積極性，加深對園區(qū)的總體印象。通 過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大部分游客都感覺婁底休閑農(nóng)業(yè)園的農(nóng)事體 驗活動較少，且方式單一，除常見的采摘外，沒有其他較有 特色的農(nóng)事體驗活動來滿足游客的不同需求。3.2.4 垂直綠化有待加強 。 垂直綠化是現(xiàn)代園林工程中的 一個重要組成部分，不僅能增加綠色空間，還可以在夏季起 到降溫減塵的良好生態(tài)效應(yīng)。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，婁底市的休閑農(nóng) 業(yè)園垂直綠化應(yīng)用現(xiàn)狀不容樂觀。一是應(yīng)用較少，大部分建 筑墻面、圍墻、花架、坡地、山石都缺乏垂直綠化；二是垂直 綠化植物應(yīng)用種類有限，主要為扶芳藤、金銀花、爬山虎、紫 藤、迎春、洋常春藤這幾種。4 參考

21、文獻1 袁凌.深圳青青觀光農(nóng)場總體規(guī)劃構(gòu)思及規(guī)劃設(shè)計J.建筑學(xué)報，1996（10）：46-49.2 楊雄楚，滕典，朱定廣.上海孫橋現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開發(fā)區(qū)詳細規(guī)劃J.時代建 筑，1997（2）：37-39.3 袁梅，林萍，劉洋 ， 等. 云南鄉(xiāng) 村旅 游地 植物 景觀配 置現(xiàn) 狀及 其對 策J.桂林旅游高等?？茖W(xué)校學(xué)報，2006（2）：173-175.4 徐 琴 ， 陳 月 華 ， 熊 啟 明. 鄉(xiāng) 村 植 物 景 觀 設(shè) 計 探 討J. 江 西 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報 ，2007（3）：72-74.5 余莉莉 ，郝日明.鄉(xiāng)村景觀對城市景觀規(guī)劃設(shè)計 的啟 示J. 金 陵科 技 學(xué)院學(xué)報，2008（2）：65-6

22、7.6 崔 衛(wèi) 東 ， 陳 慧 卿. 休 閑 農(nóng) 業(yè) 農(nóng) 業(yè) 發(fā) 展 新 模 式 J. 中 國 經(jīng) 貿(mào) ，2003（7）：38-39.!8 任中海 ，仝運科，張成輝，等.羥基喜樹堿抗癌譜的 實驗 研究J. 腫瘤防治雜志，2002，9（1）：27-29.9 張馨欣，甘勇，楊星鋼，等.聚乙二醇修飾的羥基喜樹堿納米脂質(zhì)載體 的制備及其小鼠組織分布J.藥學(xué)學(xué)報，2008，43（1）：91-96.10 西娜，侯連兵.羥基喜樹堿兩親性嵌段共聚物納米粒的制備及性質(zhì)J.中藥材，2009，32（4）：604-607.11 嚴鴻飛 ，蔣國強，孫佳麗， 等. 羥基 喜樹 堿- 聚 乙二醇 固體 分散 體的 穩(wěn)定性J

23、.清華大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，48（12）：2126-2128.12 郭偉，謝俊，楊靜，等.羥基喜樹堿脂質(zhì)體的制備及質(zhì)量評價研究J.藥學(xué)與臨床研究，2008，16（4）：274-277.13 西娜，侯連兵，王春霞，等.羥基喜樹堿半固體脂質(zhì)納米粒的制備和 體外釋藥特性J.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27（2）：139-142.14 鄭曉清，張鈞壽，周建平.羥基喜樹堿固體自微乳和速釋微球結(jié)腸定位 膠囊的大鼠體內(nèi)藥動學(xué)J.藥學(xué)與臨床研究，2008，16（4）：253-257.15 鄭曉清，張鈞壽.羥基喜樹堿自微乳的制備及大鼠體內(nèi)藥動學(xué)J.中 國藥科大學(xué)學(xué)報，2008，39（2）：132-13

24、5.16 文柳靜.羥喜樹堿凍干粉針和納米制劑在原位肝腫瘤小鼠的組織分 布研究J.西北藥學(xué)雜志，2011，26（1）：40-43.（上接第 139 頁）4 參考文獻1 李慶勇，祖元剛，付玉杰，等.10-羥基喜樹堿衍生物的合成及體外抑 制腫瘤活性J.藥學(xué)學(xué)報，2004，39（7）：521-524.2 齊菲.羥基喜樹堿劑型的研究進展J.中國藥業(yè)，2005，14（9）：93-94. 3 LI Q Y，LIU C，ZHAO X H，et al.Preparation，characterization and targetingof micronized 10-hydroxycamptothecin-loaded folate-conjugated human serum albumin nanoparticles to cancer cellsJ.Int J Nanomedicine，2011，6（3）：1-9.4 陳