淺談緊密連接蛋白claudin-6通過(guò)p38 MAPK途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡

1、淺談緊密連接蛋白claudin-6通過(guò)p38 MAPK途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡    緊密連接是內(nèi)皮和上皮細(xì)胞之間重要的連接形式，對(duì)于維持細(xì)胞極性和通透性方面發(fā)揮著重要作用。Claudins是構(gòu)成緊密連接的一種重要的跨膜蛋白。近年的研究表明，緊密連接參與了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程調(diào)節(jié)了細(xì)胞的增殖和凋亡。Claudin蛋白通過(guò)胞漿區(qū)的羧基末端的PDZ結(jié)合序列與細(xì)胞骨架蛋白或信號(hào)蛋白相結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理活動(dòng)。Claudin-6為claudin蛋白家族成員之一。我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比穩(wěn)定過(guò)表達(dá)claudin-6的MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，且流式細(xì)胞術(shù)檢

2、測(cè)細(xì)胞存在著一定的死亡，為證實(shí)這種死亡部分是由凋亡造成的，我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)染claudin-6前后細(xì)胞的凋亡及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，本論文初步探討了claudin-6在MCF-7細(xì)胞凋亡中的作用。 參考更多臨床藥學(xué)論文 1 材料和方法    1.1 材料 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)claudin-6的MCF-7細(xì)胞為本室保存。原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡的TUNEL試劑盒和DAPI染料購(gòu)自德國(guó)Roche公司。Annexin- /PI apoptosis 試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。 TRIZOL reagent和RT-PCR試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。 Dulbecco

3、s modified Eagles medium (DMEM) 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和G418均為Gibco 公司產(chǎn)品?？谷肆姿峄痯38抗體購(gòu)自Cell SignalingTechnology。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑SB203580購(gòu)自Calbiochem公司。1.2 方法    1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：以下實(shí)驗(yàn)均分為三組，對(duì)照組（control）為未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞；空載組（vector）為轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組為穩(wěn)定表達(dá)claudin-6的MCF-7細(xì)胞組（C1-C2） 。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。1.2.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按TUN

4、EL試劑盒說(shuō)明進(jìn)行：取細(xì)胞爬片，用胃蛋白酶37消化 60min；PBS 沖洗，加 50l 的0.3H2O2 甲醇溶液，PBS沖洗；加 25l 的 TUNEL 反應(yīng)溶液，37孵育60min；PBS 沖洗，加 25l 的辣根過(guò)氧化物酶抗體，濕盒中 37孵育60min；PBS 沖洗，加一滴新鮮配制的DAB 室溫孵育10min，PBS 沖洗；蘇木精復(fù)染核，酒精脫水，干燥；中性樹(shù)膠封片，光鏡觀察，細(xì)胞核棕色者為陽(yáng)性。1.2.3 Annexin- /PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作：常規(guī)胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至 5×105-1×106個(gè)/ml。取 1ml細(xì)胞 10

5、00rpm，4離心 10min 后棄上清。加入1ml冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮， 1000rpm， 4離心 10min 后棄上清。將細(xì)胞重懸于200ul Binding Buffer，加入10ul AnnexinV-FITC和 5ul PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng) 15min 或 4反應(yīng)30min后將染色后的細(xì)胞懸液加入 96 孔板中，在 1h 內(nèi)用熒光顯微鏡檢測(cè)。陽(yáng)性結(jié)果判斷：綠色為早期凋亡細(xì)胞，紅色為晚期凋亡細(xì)胞。1.2.4 DAPI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取固定好的細(xì)胞爬片，常規(guī)水化后滴加濃度為100ng/ml的DAPI染液，室溫染色10min，流水沖去染液，濾紙吸除多余水分，加一滴熒光

6、封片液，置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)360-400nm。陽(yáng)性結(jié)果判斷：細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期，期的細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)； a 期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化； b 期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)Bcl-2和Bax mRNA水平 細(xì)胞培養(yǎng)至完全匯合時(shí)，使用TaKaRa TRIZOL Reagent Kit，按說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。從Primer Bank中獲得人類Bcl-2和Bax基因引物序列。人Bcl-2上游引物為： 5- CCAAGAATGCAAAGCACA

7、CTG-3 ，下游引物：5-CCCAGCCTCCGTTATCCTG -3，擴(kuò)增片段為711bp；Bax上游引物為：5-CTGGACAGTAACATGGAGCTG-3 ，下游引物為 5-GGCGTCCCAAAGTAGGAGA-3，擴(kuò)增片段為296bp。人-actin作為內(nèi)參照，引物序列如下：上游為5-CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC-3，下游為5-CTCCTT AAT GTC ACG CAC GAT-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為250bp，引物由上海生工合成。PCR產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠分析。1.2.6 Western blotting檢查磷酸化p38表達(dá)：用0.01M PBS沖洗

8、培養(yǎng)融合至80%的細(xì)胞，加入450l裂解液（1mM NaHCO3和10mM PMSF）后用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下收集到EP管中，15，000rpm離心，收集上清蛋白樣品，用BCA ProteinAssay Kit（美國(guó)Pierce公司）對(duì)每種蛋白樣品定量。每種樣品取20g進(jìn)行變性蛋白電泳，凝膠濃度為12%。電泳結(jié)束后將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上（美國(guó)Millipore公司），5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜后，將硝酸纖維素膜放入一抗室溫孵育1h。洗膜后，將膜與HRP-結(jié)合的二抗室溫孵育1h。洗膜后用ECL Westernblotting system（美國(guó)GE公司）顯色。1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)資料以均數(shù)

9、±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并用SPSS軟件16.0進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析。2 結(jié)果    2.1 Claudin-6誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡 為了檢測(cè)claudin-6是否能夠誘發(fā)MCF-7細(xì)胞凋亡，應(yīng)用TUNEL法、DAPI stain和Annexin-V/PI double stain檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率與vector組比較明顯增高。同時(shí)DAPI核染色發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定表達(dá)claudin-6的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中可見(jiàn)明顯的凋亡細(xì)胞核形態(tài)，即細(xì)胞核呈波紋狀，染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，部分細(xì)胞核裂解為碎塊。而control

10、組細(xì)胞的自然凋亡率與vector組比較，差異無(wú)顯著性意義，結(jié)果如圖4所示。上述結(jié)果說(shuō)明，claudin-6促進(jìn)了MCF-7細(xì)胞凋亡。2.2 Claudin-6刺激MCF-7細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活 ERK、p38 MAPK和PI3KMAPK等信號(hào)途徑在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用。 在claudin-6表達(dá)的MCF-7細(xì)胞中，claudin-6是否激活這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控？應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中上述信號(hào)途徑的激活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在claudin-6表達(dá)的MCF-7細(xì)胞中p38 MAPK途徑明顯處于激活狀態(tài)，如圖5、6所示。上述結(jié)果提示claudin-6表達(dá)

11、激活了p38 MAPK途徑。2.3 抑制劑對(duì)不同信號(hào)途徑的抑制作用 為進(jìn)一步明確p38 MAPK信號(hào)途徑在claudin-6介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用，我們應(yīng)用該信號(hào)途徑特異性抑制劑，觀察其是否能選擇性阻斷相應(yīng)的信號(hào)途徑：p38 MAPK抑制劑SB203508。應(yīng)用Western blot檢測(cè)p38 MAPK信號(hào)途徑活化狀態(tài)，結(jié)果如圖7-12所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)p38 MAPK途徑的確能夠被特異性抑制劑SB203580明顯抑制，而claudin-6的表達(dá)未受影響。2.4 p38 MAPK信號(hào)途徑在表達(dá)claudin-6的MCF-7細(xì)胞中凋亡調(diào)控的作用 為明確p38 MAPK途徑在claudin-6誘導(dǎo)

12、MCF-7細(xì)胞凋亡中的作用，我們用SB203580處理各組細(xì)胞，然后應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用SB203580阻斷p38MAPK途徑后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞claudin-6的促凋亡作用被抑制，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡降低，如圖13、14所示。上述結(jié)果表明，MCF-7細(xì)胞中claudin-6的促凋亡作用是通過(guò)p38 MAPK途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的。3 討論    Claudins 是構(gòu)成細(xì)胞緊密連接的一類重要的跨膜蛋白，其表達(dá)和定位對(duì)于緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的完整性都非常重要。Claudin-6 是 claudins 家族成員之一。近來(lái)的研究表明 clau

13、dins 表達(dá)改變與上皮來(lái)源的腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)。在某些特定上皮來(lái)源腫瘤中 claudins 表達(dá)異常，例如 claudin-1 表達(dá)下調(diào)或claudin-3 和-4 上調(diào)能夠增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性，促進(jìn)瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。臨床上，某些claudins 表達(dá)異常是判斷侵襲性腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)。因此，確定claudins 在腫瘤發(fā)病中的作用能夠?yàn)槲覀兏钊氲牧私饽[瘤發(fā)生及惡變的機(jī)制提供幫助。我們?cè)谇捌诘难芯抗ぷ髦锌寺『丸b定了腫瘤抑制相關(guān)基因claudin-6，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染claudin-6真核表達(dá)載體的MCF-7細(xì)胞單克隆，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)claudin-6后生物學(xué)行為發(fā)生了很大改變，比較突出的變化就

14、是細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢并且出現(xiàn)了明顯的死亡，為驗(yàn)證這種死亡部分是由于細(xì)胞凋亡造成的我們對(duì)轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞進(jìn)行了凋亡的檢測(cè)并比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，claudin-6表達(dá)細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過(guò)程，對(duì)于有機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，凋亡的缺失常常是腫瘤發(fā)生的原因之一。許多因素都可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而不同誘導(dǎo)因素可經(jīng)不同途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同一種誘導(dǎo)因素在不同條件下的作用機(jī)制也不盡相同。因此，我們推測(cè) MCF-7 細(xì)胞中 claudin-6 表達(dá)的缺失導(dǎo)致細(xì)胞逃避了凋亡，并且在癌變過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用。而且，Makoto 等人發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞中 claudin-6基因表達(dá)沉默使

15、細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性降低。此外該研究組證明抑制 occludin 能導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)致凋亡因素的抵抗性增加以及能逃逸細(xì)胞老化程序，因此增強(qiáng)了癌細(xì)胞的致癌、侵襲及轉(zhuǎn)移能力。目前關(guān)于claudins誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究甚少，因此本研究為探討claudins促瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)理提供了線索。本文報(bào)道了在MCF-7細(xì)胞系中，claudin-6表達(dá)上調(diào)能明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑瘤作用。凋亡在防止癌癥的發(fā)生和維持阻止穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要的作用。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)凋亡活性的缺失促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。因此，更好理解claudin-6表達(dá)缺失誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。 此外，claudin-6

16、的表達(dá)也降低了癌細(xì)胞的惡性表型，如侵襲和遷移活性，從而抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。接著我們對(duì)claudin-6誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè)。至今，關(guān)于claudins參與的信號(hào)通路研究甚少，但是發(fā)現(xiàn)其與一些信號(hào)通路有關(guān)。如Taddei等人發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在鼠胚胎干細(xì)胞中claudin-5表達(dá)上調(diào)時(shí)PI(3)KAkt pathway途經(jīng)被激活。Kun Zhang等人發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞系T47D中claudin-1表達(dá)下調(diào)能夠激活Erk1/2途經(jīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性增加。此外，Oshima等人發(fā)現(xiàn)應(yīng)用阿司匹林處理人類胃癌細(xì)胞系MKN28能通過(guò)claudin-7激活p38 MAPK途徑，降低單層培養(yǎng)細(xì)胞的跨上皮電

17、阻，提高跨上皮的滲透性。因此，我們檢測(cè)了細(xì)胞在轉(zhuǎn)染claudin-6前后上述通路的活化狀態(tài)， 同時(shí)應(yīng)用各通路抑制劑進(jìn)一步確定上述通路在claudin-6誘導(dǎo)凋亡中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比p38 MAPK途徑在claudin-6表達(dá)細(xì)胞中處于高度活性狀態(tài)，而被檢的其它信號(hào)蛋白磷酸化Erk1/2和Akt在各組間沒(méi)有明顯差別。隨后我們應(yīng)用通路特異性抑制劑進(jìn)一步驗(yàn)證了假設(shè)。結(jié)果表明應(yīng)用通路特異性抑制劑后磷酸化的p38明顯減少，而其它被檢的信號(hào)蛋白改變不明顯。p38 MAPK途徑主要參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，還參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用。研

18、究發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞在受到不同刺激影響時(shí)，p38 MAPK所扮演的角色是完全不同的。一些研究者發(fā)現(xiàn)p38 MAPK途徑活化通過(guò)介導(dǎo)caspase激活或p53磷酸化誘導(dǎo)凋亡p38 MAPK參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，與誘導(dǎo)bax轉(zhuǎn)位；介導(dǎo)caspase的活化；p53磷酸化及增強(qiáng)TNF的表達(dá)介導(dǎo)的凋亡有關(guān)。但也有研究表明，p38MAPK信號(hào)通路也通過(guò)抑制前凋亡信號(hào)的產(chǎn)生，參與介導(dǎo)細(xì)胞存活信號(hào)通路而抑制細(xì)胞凋亡。在本研究中，p38在claudin-6表達(dá)的MCF-7細(xì)胞中明顯處于活化狀態(tài)，加入抑制劑后可明顯抑制其活化。因此，我們假設(shè)應(yīng)用通路特異性抑制劑也能影響到claudin-6介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移表型。為驗(yàn)證這一假設(shè)，我們檢測(cè)了應(yīng)用p38通路特異性抑制劑前后細(xì)胞的凋亡、侵襲和遷移活性。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，claudin-6表達(dá)克隆C2的細(xì)胞凋亡明顯降低（Fig.3A right，C2），克隆C1的細(xì)胞凋亡率也呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。我們的結(jié)果表明，表達(dá)claudin-6的MCF-7細(xì)胞凋亡部分是由p38 MAPK途徑介導(dǎo)的。此外，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)p38途徑受到抑制時(shí)，claudin-6表達(dá)的MCF-7的侵襲和遷移活性增高。眾所周知侵襲和遷移活性能夠反映腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。因此，我們的結(jié)果表明c