細(xì)胞懸液法與組織塊埋植法制作兔VX2肝癌影像模型的對(duì)照研究

1、細(xì)胞懸液法與組織塊埋植法制作兔VX2肝癌影像模型的對(duì)照研究                        作者：郭興 丁偉 李雪鵬 宋惠坤   【摘要】  目的：通過(guò)對(duì)照細(xì)胞懸液法與組織塊埋植法，選擇較合理的兔VX2肝癌模型的造模方法。方法：取傳代荷瘤VX2種兔，分離腫瘤，制備腫

2、瘤細(xì)胞懸液和腫瘤組織塊，取新西蘭大白兔各10只，分別經(jīng)超聲導(dǎo)引肝內(nèi)注射和開(kāi)腹肝內(nèi)組織塊埋植，3周后處死模型兔，觀察原位腫瘤大小，肝內(nèi)、腹腔及肺部轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果：兩種方法造模，成模率均為100；組織塊埋植法組原位腫瘤體積明顯大于細(xì)胞懸液組；組織塊埋植造模較少引起異位種植，腫瘤生長(zhǎng)較為均一。結(jié)論：組織塊埋植法優(yōu)于細(xì)胞懸液法。 【關(guān)鍵詞】  VX2 肝癌 動(dòng)物模型Abstract  Objective:To choose a better method to make&#

3、160;a rabbit VX2 liver cancer model through cell suspension injecting and tissue lump embedding. Methods： After separating the tumors in cancer bearing VX2 rabbit, cells suspe

4、nsion and tissue lump were prepared. Then the cells suspension was injected into ten New -Zealand albino rabbits livers through hypersound .And tissue lumps were embedded 

5、;into another ten New -Zealand albino rabbits livers .After 3 weeks, model rabbits were executed ,the size of tumors ,intra-liver, enterocoelia, bellows transfer were recorded.

6、0;Results： The achievement ratio of VX2 model was 100% for these two methods. The size of tumor in tissue lump embedding group was significantly larger than cell sus

7、pension injecting group. Ectopia plant was much less in tissue lump embedding group, and the tumors were uniform. Conclusion： The method of tissue lump embedding was bett

8、er than cell suspension injecting.    Key words  VX2；Liver cancer；Rabbit modelVX2腫瘤細(xì)胞株是由shope病毒誘發(fā)兔乳頭狀瘤衍生的鱗狀細(xì)胞癌，經(jīng)過(guò)移植傳72代后正式建株、命名，。由于兔缺乏對(duì)VX2細(xì)胞的免疫，可直接移植至肝、腎、肌肉等器官建立原位模型，是目前較常使用的醫(yī)學(xué)影像模型。文獻(xiàn)報(bào)道VX2肝癌模型的制作方法主要包括細(xì)胞懸液法和組織塊埋植法，本研究通過(guò)兩種造模方法對(duì)照，以探討較為簡(jiǎn)便

9、實(shí)用，成模率高的模型制作方法。1  材料和方法1.1  材料          新西蘭大白兔40只，2 kg2.2 kg，雌雄各半，四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 合格證號(hào)：10）荷瘤VX2種兔 (由華中科技大學(xué)介入科馮敢生教授惠贈(zèng))，超聲診斷儀（惠普HDI 5000，美國(guó)），CO2孵箱(SANYO, MCO-17A2,日本)，倒置顯微鏡（OLYMPUS, 日本），血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，DMEM培養(yǎng)

10、液（自制），PBS緩沖液（自制），顯微手術(shù)器械。1.2  方法1.2.1  細(xì)胞懸液及腫瘤組織塊制備：取傳代中大腿荷瘤種兔一只，提前一天大腿內(nèi)側(cè)備皮，腹腔內(nèi)注射10水合氯醛2.5 mL/kg，安定2.5 mg/kg，麻醉后，碘伏大腿內(nèi)側(cè)及腹股溝區(qū)消毒，剪開(kāi)局部皮膚，分離皮下組織，細(xì)心分離腫瘤，將腫瘤完整取出。剪開(kāi)腫瘤，置于37 PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，用解剖鑷細(xì)心分離腫瘤組織，將血管及壞死組織分離清除干凈，置于盛DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，取魚肉樣腫瘤組織分別制備細(xì)胞懸液和組織塊：用眼科剪剪碎成約1 mm大小，

11、60;2 mL勻漿器勻漿，制備細(xì)胞懸液，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，達(dá)到>107 cell/mL；將腫瘤組織剪成約4 mm×4 mm×4 mm大小組織塊，置DMEM培養(yǎng)液中。細(xì)胞懸液及組織塊制備完成后，放入5CO2孵箱待用。以上操作在超凈工作臺(tái)完成，保證無(wú)菌。1.2.2  腫瘤肝內(nèi)接種：健康2 kg2.2 kg新西蘭大白兔20只，隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為組織塊組和細(xì)胞懸液組，分別采取如下方法行腫瘤接種，組織塊組：兔上腹部提前一天備皮，麻醉后固定于兔臺(tái)，消毒上腹部皮膚

12、、鋪無(wú)菌單，劍突下3 cm縱行切開(kāi)約2 cm3 cm切口，暴露肝臟，用手術(shù)刀柄將肝左外葉輕輕挑出，使用1號(hào)絲線穿過(guò)肝臟，慢慢將肝臟拉出切口，無(wú)菌紗布保護(hù)切口，在肝左外葉有肝左中葉覆蓋部分用眼科剪剪約0.5 cm的小口，用解剖鑷伸入切口沿肝臟走行方向造成深約1 cm的隧道，鑷取已經(jīng)準(zhǔn)備好的4 mm×4 mm×4 mm 的腫瘤組織塞入隧道內(nèi)，剪取一小塊明膠海綿填堵切口。抽出一號(hào)絲線，將肝臟慢慢送入腹腔后關(guān)腹;細(xì)胞懸液組：動(dòng)物術(shù)前準(zhǔn)備同前組，固定、麻醉完成后，置于超聲檢查床，抽取細(xì)胞懸液0.

13、2 mL，超聲導(dǎo)引下經(jīng)皮穿刺，將細(xì)胞懸液注入肝左外葉。接種完成后連續(xù)3 d肌注青霉素5萬(wàn) U/kg，慶大霉素2.5 mg/kg(或0.25萬(wàn)U/kg)。1.2.3  成瘤觀察：按以上兩種方法接種完成后，送動(dòng)物室飼養(yǎng)3周，按腫瘤接種麻醉方法麻醉荷瘤兔，觸摸心臟波動(dòng)最強(qiáng)烈部位，用10 mL注射器心臟穿刺，注射空氣，處死。剖腹，觀察腹腔內(nèi)肝外臟器、腹腔（包括壁層腹膜及網(wǎng)膜）及腹壁有無(wú)腫瘤種植，并記錄。分離肝臟將肝臟完整取出，觀察肝臟表面腫瘤原種植部位腫瘤大小，分離出腫瘤，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)徑(a)及短徑(b)，按以下公式計(jì)算

14、腫瘤體積（V）：V (cm3) =ab2/6。同時(shí)觀察肝臟表面其他部位有無(wú)轉(zhuǎn)移病灶。1.2.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，描述性統(tǒng)計(jì)分析，腫瘤大小比較符合參數(shù)檢驗(yàn)條件，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，腫瘤成模率及異位轉(zhuǎn)移比較采用Fishers確切概率法檢驗(yàn)。2  結(jié)果          組織塊接種組腫瘤體積明顯大于細(xì)胞懸液接種組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且前者極差及變異系數(shù)明顯小于后者，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1；除組織塊組其中一只

15、因腹瀉死亡，兩組存活動(dòng)物肝內(nèi)均有腫瘤生長(zhǎng)；組織塊組和細(xì)胞懸液組發(fā)生腹腔、肝內(nèi)和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的比例分別：22、33、0和80、100、20，組織塊組較少發(fā)生異位種植，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。表1  不同方法制作的VX2肝癌模型原位腫瘤大?。裕┍?  不同方法造模VX2肝癌異位種植情況（略）*與組織塊組對(duì)照差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.017；*與組織塊組對(duì)照差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.000。3  討論           

16、 VX2肝癌腫瘤模型是目前唯一的可接種的中等動(dòng)物模型，。由于VX2腫瘤細(xì)胞惡性度極高，侵襲性強(qiáng)，極易發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移，不能作為生存率評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型。目前VX2肝癌模型常作為影像學(xué)診斷的評(píng)價(jià)，也作為肝癌介入治療評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型。但是腫瘤的大小直接依賴于接種細(xì)胞和腫瘤組織的量，腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織的植入方法將直接影響成模腫瘤的大小。目前文獻(xiàn)報(bào)道VX2肝癌模型的制作方法主要包括肝內(nèi)細(xì)胞懸液注射和肝內(nèi)組織塊填埋，腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織的植入途徑包括開(kāi)腹肝內(nèi)細(xì)胞懸液注射、CT或超聲導(dǎo)引下經(jīng)皮肝穿刺肝內(nèi)注射、開(kāi)腹肝內(nèi)組織塊填埋。王曉東等對(duì)VX2活細(xì)胞數(shù)與肝癌模型成瘤率及成模時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行了研究，指出細(xì)胞數(shù)

17、>1×105成模率達(dá)到90100，成模時(shí)間與接種細(xì)胞數(shù)相關(guān)，接種細(xì)胞數(shù)越多成模時(shí)間越短。較多學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞懸液直接注射接種方便可靠，成模率高。褚朝順等認(rèn)為肝內(nèi)組織塊植入，生物膠封口可以提高成模率，減少肝外轉(zhuǎn)移。          本試驗(yàn)對(duì)經(jīng)皮肝穿刺腫瘤細(xì)胞懸液注射和開(kāi)腹肝內(nèi)埋植不同組織塊對(duì)腫瘤成模的影響進(jìn)行考察。細(xì)胞懸液使用常規(guī)使用濃度107 cell/mL。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL不同的注射劑量進(jìn)行了初步觀察，發(fā)

18、現(xiàn)只要細(xì)胞濃度大于107 cell/mL，不同注射體積成模均為100，也證明了王曉東等得出的植入細(xì)胞數(shù)大于105，成模率90%100的結(jié)論。同時(shí)觀察到隨注射體積的增大，肝內(nèi)及肝外轉(zhuǎn)移將增加，不能形成較為孤立的腫瘤，所以采用較小體積0.2 mL。參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，在行組織塊埋植時(shí)選用約4 mm×4 mm×4 mm組織塊。由于腫瘤的成模時(shí)間決定于植入的活細(xì)胞數(shù)，綜合實(shí)驗(yàn)等待時(shí)間和腫瘤細(xì)胞、組織的植入的可操作性，將對(duì)腫瘤的觀察時(shí)間確定為3周。除組織塊組一只動(dòng)物在第6 d因腹瀉死亡外，其他動(dòng)物均成活，并且均有腫瘤生長(zhǎng)，各組間不

19、存在造模成功率的差異。這一結(jié)果驗(yàn)證了VX2成模快、成模率高的特點(diǎn)，只要接種細(xì)胞數(shù)量足夠，成模率100。細(xì)胞懸液組10只全部出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，其中有8只出現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移，并有2例出現(xiàn)了雙肺轉(zhuǎn)移，而組織塊組出現(xiàn)較少的腹腔轉(zhuǎn)移和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造成細(xì)胞懸液肝內(nèi)注射接種腹腔和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移較多的原因，可能由于穿刺針穿刺進(jìn)入肝臟之后，細(xì)胞懸液注射過(guò)程中，較多的腫瘤細(xì)胞可能進(jìn)入肝血竇，進(jìn)入血竇的腫瘤細(xì)胞可能進(jìn)入肝靜脈回流至下腔靜脈進(jìn)入肺動(dòng)脈，在肺內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，同時(shí)腫瘤細(xì)胞可能借注射器的壓力沿肝臟Glisson系統(tǒng)在肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。造成細(xì)胞懸液接種腹腔轉(zhuǎn)移的原因可能為在注射過(guò)程中，部分細(xì)胞通過(guò)穿刺針孔反流，落

20、入腹腔造成在腹腔內(nèi)種植。而單個(gè)組織塊器械夾持方便，對(duì)周圍腹腔臟器的保護(hù)較為容易，造成肝內(nèi)和肺轉(zhuǎn)移的可能性減少，同時(shí)注意保護(hù)周圍臟器，一般不會(huì)造成腹腔種植轉(zhuǎn)移，因此組織塊埋植造模原位腫瘤單發(fā)成模率高同時(shí)可減少異位種植和轉(zhuǎn)移。          兩組腫瘤體積具有較大的差異，組織塊組腫瘤明顯大于細(xì)胞懸液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是植入的細(xì)胞懸液可能借助注射器壓力，沿肝臟Glisson系統(tǒng)和組織間隙向周圍擴(kuò)散，不能聚集于局部，同時(shí)細(xì)胞懸液經(jīng)稀釋后細(xì)胞數(shù)較少。組織塊組腫瘤體積的變異系數(shù)小于細(xì)胞懸液組

21、，說(shuō)明細(xì)胞懸液組腫瘤生長(zhǎng)的均一性較差，如作為影像模型使用，差異較大的腫瘤邊界特征和腫瘤血管成熟程度以及血管密度差異可能會(huì)較大，造成模型的基線標(biāo)準(zhǔn)的不一致。因此組織塊埋植法造模，可以改善腫瘤生長(zhǎng)的均一性。          本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)照細(xì)胞懸液法和組織塊埋植法制作VX2肝癌模型，組織塊埋植法制作的腫瘤模型，具有腫瘤生長(zhǎng)較為均一，轉(zhuǎn)移少，腫瘤大小較好控制的特點(diǎn)。同時(shí)操作較為簡(jiǎn)便，具備一般的外科學(xué)常識(shí)即能完成造模，熟練后，整個(gè)操作在5 min內(nèi)可完成。而細(xì)胞懸液法制作模型，雖不需外科操作，但需借助CT或超聲導(dǎo)引，造模成本增高，同時(shí)成模腫瘤生長(zhǎng)不一致，具有較高的轉(zhuǎn)移率。因此組織塊埋植法制作兔VX2肝癌模型優(yōu)于細(xì)胞懸液法?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】   Swistel AL, Bading JR, Raaf JH, et al. Intra-arterial versus