積雪草酸對(duì)肝癌細(xì)胞增殖作用的影響

1、積雪草酸對(duì)肝癌細(xì)胞增殖作用的影響作者：周軍，高靜，方春錢，林娜，嚴(yán)麗芳【摘要】目的：研究積雪草酸(asiatic acid, AA)對(duì)人肝癌細(xì)胞 株(HepG2)的抑制作用，并探討其與線粒體之間的關(guān)系。方法=采用MTT法檢測(cè)AA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞 形態(tài)的 變化；熒光探針MitoTracker檢測(cè)線粒體數(shù)目；熒光探針JC_1檢測(cè)線粒體膜電位；熒光探針DCFHjDA檢測(cè)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS )含量；ATP試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)平;RT PCR和Wester n Blot法分析電壓依賴性陰離子通道(voltage _dependen

2、t anion channel , VDAC )表達(dá)量的變化。結(jié)果:AA能夠劑量依賴性抑制腫瘤細(xì)胞株的增殖，30呵ol/L AA作用細(xì)胞24 h后細(xì)胞突起消失、胞體皺縮、變圓。AA能夠使HepG2細(xì)胞線 粒體膜電位下降，胞內(nèi)ROS含量增加，降低胞內(nèi)ATP水平，50P Pmol/L AA能(作者:單位:郵編:ATP水增殖的作用與線粒體有關(guān)，線粒體VDAC參與人肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào) 控過 程?！娟P(guān)鍵詞】積雪草酸；線粒體；電壓依賴性陰離子通道；肝癌細(xì)胞Abstract Objective: To investigate the proliferation inhibition ofasiatic aci

3、d(AA) on the huma n hep atom a cell li ne(He pG2) cells, and tostudy its pote ntial correlati on with mitoch on dria.Methods The effect ofAA on proliferation of HepG2 was tested by MTT, morphology of tumor cellswas observed un der inv erted microscope; the mitochondrial mass was describedby the fluo

4、resce nee inten sity of MitoTracker probe, mitocho ndrial membrane pote ntial was detected with fluoresce nt probe JC_1, intracellularreactive oxygen species(ROS) content was detected with DCFHDA ,intracellular ATP level was measured by ATP Assay Kit, and the expressionof voltage dependent anion cha

5、 nn el(VDAC) on mitoch on drial outer membrane was determ ined by RTPCR and Western Blot,Results : AA inhibited the proliferatio n of tumor cell li nes(HepG2) dose_depe nden tly, and cells rounded and shrank after treated with 30 mol/LAA for 24 h,Mitochondrial membrane potential depolarized, in trac

6、ellular ATPlevel decreased and ROS con tent i n creased dosejdepe nden tly after treating with AA, and VDAC expressi on was up _ regulated by 50 gol/L AA, Conelusion : AA exerted anti Jtumor effects, which was related with mitochondriamediated death, and VDAC was invo Ived in the cell death pathway.

7、Key words asiatic acid; mitochondria; voltage dependentanion channel (VDAC ); HepG2 cells肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，死亡率高。抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘 導(dǎo) 腫瘤細(xì)胞凋亡，是抗腫瘤藥物作用的共同機(jī)制。線粒體在細(xì)胞死亡調(diào)控 中發(fā)揮重要的作用，已成為癌癥化學(xué)療法的靶點(diǎn)1，通過線粒體途徑 誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，是目前抗腫瘤藥研發(fā)的重要方向之一。積雪草酸（asiatic acid, AA）,又名亞細(xì)亞酸，是我國傳統(tǒng)中藥積雪草夠增加VDAC蛋白的表達(dá)量。結(jié)論:AA抑制腫瘤細(xì)胞的五環(huán)三祜類組分之一。經(jīng)研究證明，AA具有對(duì)抗CC

8、I4和DGalN誘導(dǎo) 的肝損傷2,3、減弱化療藥物抗腫瘤的不良反應(yīng)4、對(duì)抗神經(jīng)細(xì) 胞的氧化損傷5等作用。另外，也發(fā)現(xiàn)AA具有抑制黑色素瘤細(xì)胞增 殖6 、誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞凋亡的作用7。本研究探討了AA對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2增殖的抑制作用及其與線粒體之間的關(guān)系。1材料與方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)材料HepG2（人肝癌細(xì)胞株）由南京大學(xué)徐力致老師惠贈(zèng)。（Sigma公司產(chǎn)品，美國）；MEM培養(yǎng)基（Gibco公司產(chǎn)品，美國）；0.25%胰蛋白酶（Amresco公司產(chǎn)品，美國）；胎牛血清（杭州四季 青 生物工程公司產(chǎn)品）/MitoTracker Red FM （Invitrigen公司，美國）JC_1 （

9、Molecular Probes公司，美國）；MTT （Amresco公司產(chǎn)品, 美國）；鼠抗人訂肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（Abeam公司，美國）；鼠抗 人VDAC抗體（Abeam公司，美國）；羊抗小鼠IgG HRP （horseradish peroxidase）（武漢博士德生物工程有限公司）；ECL超級(jí)發(fā)光液（碧云天生物工程公司）；考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒（南京建成生物工 程 研究所）；其余未特殊注明的試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。1.1.2主要儀器Spectra Max 190酶標(biāo)儀（Molecular device,美國）；SpectraMaxGemini熒光酶標(biāo)儀（Molecular devi

10、ce，美國）；核酸蛋白分析 儀（島津公司，日本）；BioRad電泳儀（BioRad,美國）；TE2000熒光 顯微鏡（尼康公司，日本）。AA1 2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞用含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細(xì)胞接 種于培養(yǎng)瓶中，置于37 Cv 5% CO2,飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，23d傳代1次。1.2.2 MTT法測(cè)細(xì)胞存活率4 X104 ml-1細(xì)胞100山接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,加不同濃度AA處理24h，棄去培養(yǎng)基，每孔加100山MTT （Dhanks液溶解，濃度為1g/L） , 37 C繼續(xù)孵育4 h后，吸去培養(yǎng)液，每孑L加DMSO 100山 待結(jié)晶物充

11、分溶解,1 h后用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)光密度。結(jié)果用抑制率表示，計(jì)算公式如下:抑制率二對(duì)照組平均D570-給藥組平均D570對(duì)照組平均D570-空白組平均D570X100%123 MitoTracker染色檢測(cè)線粒體數(shù)目HepG2細(xì)胞經(jīng)10, 30, 50町iol/L AA處理24 h后，用MitoTracker探針檢測(cè)線粒體數(shù)目的變化，吸去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基,加入37C預(yù)溫的含100 nmol/L MitoTracker的培養(yǎng)基100 ill 37 C孵育30 mine PBS洗2次，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度（ nm/Em644 nm）。1.2.4 JC1染色測(cè)線粒體膜電位4 X103個(gè)He

12、pG2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，以不同濃度AA作用于HepG2細(xì)胞24h后，吸掉培養(yǎng)基，加入2.5血/ml的JC1染料，37 C下避光孵育10 min, PBS洗2次，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光 強(qiáng)度1.2.5 ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)定胞內(nèi)ATP水平1.5X104個(gè)HepG2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，以不同濃度AA作用24 h后，吸掉培養(yǎng)基，每孔加入200山裂解液裂解細(xì)胞。加100“ATP檢測(cè)試劑到檢測(cè)孔內(nèi)，室溫放置35 min后，再在檢測(cè) 孔內(nèi)加上Ex588（Ex488 nm/Em525 ,590 nm ）。100山裂解細(xì)胞樣品，迅速用槍混勻，間隔2 s后，立即用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。126 DCF

13、H QDA探針法檢測(cè)胞內(nèi)ROS含量4 X104 ml-1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)24 h,經(jīng)不同濃度的AA處理24 h后，加入無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFHDA溶液，使其終濃度 為W呵ol/L, 37 C下負(fù)載探針30 min, PBS洗2次。用熒光酶標(biāo) 儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度（EX488 nm/Em525 nm ），同時(shí)用熒光顯微鏡觀察細(xì) 胞的形態(tài)及熒光。1.2.7肝癌細(xì)胞VDAC基因檢測(cè)127.1 mRNA 7K平反轉(zhuǎn)錄采用Invitrogen公司試劑盒說明書所述步驟；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增反應(yīng)體系：2.5 Lij 10 X緩沖液，1 L1I dNTP , 2山MgCI2 , 0 5訕Taq DNA

14、聚合酶，1訕cDNA模板，1訕引物（VDAC）JA, 1 pl引物（VDAC） _S, 1“引物（円肌動(dòng)蛋白）A, 1山引物（討肌動(dòng)蛋白）S, 13訕無菌水；引物序列為引物（VDAC） S :AGTGTGACGTTGACATCCGTA 3 弓丨物（VDAC） A : GCCAGAGCAGTAATCTCCTTCT3弓I物（伏肌動(dòng)蛋白S: 5 * GGCTACGGCTTTGGCTTAAT 3 /引物（B肌動(dòng)蛋白）A:CCCTCTTGTACCCTGTCTTGA 3 。反應(yīng)先經(jīng)過95 9 2 min,然28個(gè)循環(huán)：94C 30 S ,50 C 30 s ,72 C 30 s,最后于72 C延伸反應(yīng)4m

15、ine PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。127 2蛋白水平5后是采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。提取各組細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量后，樣品按比例加入3X SDS凝膠上樣緩沖液溶解，煮沸5 mine以20血蛋白進(jìn)行上樣，電泳50V恒壓4h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；封閉液(1g脫脂奶粉，0.2 g BSA溶于20 ml PBST溶液)封閉1h;抗孵育(抗VDAC抗體1 2000;抗也肌動(dòng)蛋白抗體1 : 000) 4C過夜；PBST清洗5次，每次10 min:二抗孵育(1 3000 ),室溫1h; PBST清洗5次，每次10 min : ECL發(fā)光液發(fā)光，暗室內(nèi)X光片 感光、顯影、定 影、觀察。128統(tǒng)計(jì)方

16、法數(shù)據(jù)資料以士S表示，用SAS軟件進(jìn)行單因素方差分析(one wayanalysis of varianee, ANOVA ),組間比較進(jìn)行q檢查，顯著性 標(biāo)準(zhǔn)為a=0,05,所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2結(jié)果2.1 AA抑制腫瘤細(xì)胞增殖如圖1所示，HepG2細(xì)胞經(jīng)終濃度分別為20, 30, 40 gol/L的AA溶液處理后，細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞形態(tài)改變，如突起消失，胞體皺縮變圓等。由圖2MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，低濃度AA (20 gol/L )組對(duì)HepG2細(xì)胞的生長沒有明顯影響；當(dāng)劑量達(dá)到40 mol/L時(shí)，AA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，抑制率達(dá)78%,由此AA在HepG2細(xì)胞株上

17、的IC50值為27 gol/Lo2.2 AA對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體數(shù)量的影響結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組比較,10 gol/L AA組細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加了11 %,30 gol/L AA組細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加了146% ,5 0卩mol/L AA組細(xì)胞熒光強(qiáng)度減少了44%,即線粒體數(shù)量隨著AA濃度 的升 高，有一個(gè)先升高后降低的過程。2.3 AA對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度AA處理24 h后,加JC1熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位的變化，結(jié)果見圖4o從圖4b熒光照片可見：對(duì)照組線 粒體全為 紅色，說明膜電位較高；經(jīng)20 gol/L解耦聯(lián)劑CCCP處 理2 h只見綠色熒光，膜電位降

18、低；經(jīng)40呵ol/L AA處理24 h后的HepG2細(xì)胞線粒體呈草綠色或橙黃色熒光，說明線粒體膜電位發(fā)生 不同程度地垮陷，線粒 體功能受到影響。從圖4a紅/綠熒光強(qiáng)度比值 分析直方圖可知30, 40呵ol/L AA極顯著地降低了HepG2細(xì)胞線 粒體的膜電位。2.4 AA對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體功能的影響由圖5可知，與對(duì)照組比，HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度AA處理24 h后胞內(nèi)ATP水平呈劑量依賴性地降低。胞內(nèi)ROS含量呈劑量依賴性 升高。2.5 AA對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體VDAC蛋白表達(dá)的影響由圖6a可看出，與對(duì)照組相比,10, 30, 50 gol/L AA對(duì)VDAC轉(zhuǎn)錄水平基本無影響，僅30呵

19、ol/L AA處理組VDACmRNA轉(zhuǎn)錄水平略有降低。由圖6b可知以對(duì)照組VDAC與內(nèi)參伏 肌動(dòng)蛋白免疫 條帶灰度掃描的比值為100%,貝,0, 30, 50 gol/L AA組分別為97%,187%, 397%,說明AA劑量依賴性地上調(diào)了VDAC蛋白的水平。3討論我們?cè)贖epG2腫瘤細(xì)胞株上研究了AA的體外抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)AA濃度依賴性抑制HepG2細(xì)胞株的增殖。這與之前的研究結(jié)果一致4。線粒體是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，當(dāng)線粒體受到藥物毒性 作用時(shí)，線粒體功能出現(xiàn)缺陷，線粒體數(shù)目增多可能是為了補(bǔ)償這種 缺 陷而產(chǎn)生的反饋機(jī)制8,9 0因此30 gol/L AA作用下線粒體數(shù)目增加，但膜電位明

20、顯降低，說明線粒體功能異常；當(dāng)藥物濃度繼續(xù) 增高 時(shí)，線粒體損傷加重，反饋機(jī)制受到影響，線粒體的分裂不能正常進(jìn)行10 0 50 gol/L AA嚴(yán)重?fù)p傷線粒體，使之不能分裂，各種 功能受損,線粒體數(shù)量大大減少。transition pore, mPTP）開放，導(dǎo)致線粒體膜電位垮陷，ATP水平下降，胞內(nèi)ROS產(chǎn)量增多或清除率降低，最終誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞死 亡，可 見AA可以通過線粒體介導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔mPTP由VDACv腺瞟吟核昔酸易位子(ade nine nu cleotide tra nslocator , ANT)、親環(huán)蛋白D (cycl ophilinD, Cyp

21、D）等組成，是線粒體凋亡蛋白釋放的主要通道。VDAC主要以兩種方式調(diào)控線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡=一方面作為外膜上主要的蛋白孔道參與調(diào)控外膜的通透性，另一方面是與凋亡蛋白Bclb家族AA通過誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeably蛋白相互作用調(diào)控細(xì)胞凋亡。Yagoda等11 指出VDAC可成為藥 物篩選的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室的研究表明，AA的保肝作用與逆轉(zhuǎn)VDAC水平有關(guān)2, 12 O實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AA可以劑量依賴性誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞線粒體VDAC蛋白表達(dá)量升高，AA的線粒體毒性很可能與VDAC有關(guān)。結(jié)合細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目分析可以推斷，30 gol/L AA作用時(shí)，HepG2細(xì)

22、胞VDAC蛋白量的增加與線粒體數(shù)量增加有關(guān)；50gol/L AA作用時(shí)，HepG2細(xì)胞線粒體受到嚴(yán)重?fù)p傷，線粒體數(shù)目急劇減少，而VDAC蛋白孔道表達(dá)量顯著增加，說明線粒體外膜VDAC蛋白形成的孔道增加。因此，AA的抗腫瘤作用與VDAC相關(guān)，但是其在線粒體上的靶點(diǎn)是否就是VDAC,值得進(jìn)一步探討?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Gogvadze V, Orrenius S, Zhivotovsky B,Mitochondriaas targets for cancer chemotherapyJ .Semin Cancer Biol, 2009, 19(1)：57-66,2 Gao J, Tang X, Dou

23、 H, et al,He patop rotective activityof Termi nalia catappa Leaves and its two triterpe no ids J JPharm Pharmacol 2004, 56(11): 1449-1455,：3楊光，譚家駒，何瑞華，等積雪草酸阻斷大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究J中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009, 15：540-542.：4林娜,高靜，方春錢，等積雪草酸與化療藥物聯(lián)用抗腫瘤效應(yīng)的初步研究J江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2008, 18(6):494-497.5 Lee MK, Kim SR, Sung SH, et al,Asi

24、atic acidderivatives protect cultured cortical glutamateJinduced excitotoxicity J .Res Commun Mol PatholPharmacol, 2000J 08(2): 75-86,6 Park BC, Bosire KO, Lee ES, et al.Asiatic acid in ducesapoptosis in SK MEL2 huma n mela noma cells J ,Ca ncer Lett,2005,218(1):81-90,7 Ta ng XL, Yang XY, Jung HJ, et al.Asiatic acid induces colon can cer cell growth in hibiti on and apoptosis throughmitochondrial death cascade J .Biol Pharm Bull, 2009, 32(8): 1399- 1405.8 Nugent SM, Mothersill CE, Seymour C, et al.In creased mitoch on drial mass in ce