嬰幼兒配方乳粉膽堿的測定修改說明(精)

1、嬰幼兒配方乳粉膽堿的測定修改說明1、任務來源、起草單位、驗證單位和主要起草人任務來源：國家標準化委員會起草單位：驗證單位 ：黑龍江省乳品工業(yè)技術開發(fā)中心。 主要起草人：2、原標準中膽堿測定方法簡介GB/T5413.20-1997中規(guī)定了酶比色法測定嬰幼兒食品和乳粉中膽堿的方法。該方法是等同采用AOAC的方法。自1997年GB/T5413頒布以來，我中心開展嬰 幼兒配方食品和乳粉中膽堿的測定工作。 經(jīng)過長時間的大量試驗， 認為酶比色法 測定膽堿的重現(xiàn)性、 準確性都較好。 由于該方法使用的兩種酶制劑價格昂貴、 全 部需進口， 且測定要求實驗室條件較高， 所以目前國內(nèi)只有個別外資與國內(nèi)幾家 大型乳粉

2、企業(yè)使用該方法測定膽堿。而絕大多數(shù)企業(yè) (包括質檢機構 )由于受條件限制未采用此方法。 2008年4月全國乳品標準化中心在哈爾濱組織召開了由多家乳品企業(yè)及質檢機構參加的關于 GB/T5413修訂研討會上，許多專家提出：為適應國內(nèi)目前狀況，能否增加較為操作簡便、 穩(wěn)定性好的化學方法雷氏鹽比色法。我中心因在此之前已開展了對該方法的技術資料收集及方法的研究工作。 會上一 致決定由我中心負責起草該標準方法。2005年我中心接受了國家標準化委會對 嬰幼兒配方食品和乳粉通用檢驗方 法修訂的工作。在此情況下 , 經(jīng)多方查找資料，并進行了大量的試驗驗證后， 認為雷氏鹽比色法測定膽堿是一個較為經(jīng)典、 可靠的方法

3、。 該方法操作簡便、 測 定重現(xiàn)性與再現(xiàn)性較好，不須特殊的儀器設備與試劑，一般實驗室都具備條件， 利于各乳品企業(yè)使用等特點。3、雷氏鹽比色法測定膽堿的必要性及意義膽堿( choline )是一種維生素，是人體所需要的重要營養(yǎng)素。膽堿是抗脂 肪肝因子， 可預防脂肪沉積以肝臟中， 加速脂肪進入細胞的活動， 幫助調節(jié)肝和 膽囊的功能，可預防膽結石。缺乏膽堿會引起胃潰瘍、胃出血、心臟疾病、腎管 阻塞、動脈硬化等疾病。 膽堿一般以磷酸膽堿或乙酰膽堿的形式廣泛分布在卵磷 脂、蛋黃、肝臟、啤酒小麥芽中。成年人可以從食物中獲取，所以成年人中尚未 發(fā)現(xiàn)膽堿缺乏者。 對全部依靠嬰幼兒配方乳粉提供營養(yǎng)的嬰幼兒而言，

4、 膽堿也是必不可少的營養(yǎng)成分之一被添加到嬰幼兒配方乳粉。 作為配方成分之一， 企業(yè)對 產(chǎn)品質量監(jiān)控與政府部門執(zhí)法都需要建立相應的檢測標準。 原標準中測定膽堿的 方法為酶比色法， 由于該法存在較大的局限性， 受條件限制， 絕大多數(shù)企業(yè)等都 無法采用該方法測定膽堿。 為此在標準研討會上許多代表建議增加適于企業(yè)采用 且能準確測定膽堿的化學方法， 以利于企業(yè)等對產(chǎn)品質量的監(jiān)控。 所以增加雷氏 鹽法是廣大生產(chǎn)部門及多數(shù)質檢機構所需， 企業(yè)對確保產(chǎn)品質量及政府執(zhí)法提供 技術保障，具有重要的現(xiàn)實意義。4. 制定標準的原則和依據(jù)。在所查閱的很多文獻中， 雷氏鹽比色法測定膽堿適應性較廣， 可適用于幾乎所有的食品

5、及添加劑等。目前在現(xiàn)行的國家標準GB/T17481-1998預混料中膽堿的測定 分光光度法、行業(yè)標準 HG/T 2941-2004 飼料級 氯化膽堿中， 采用的就是雷氏鹽法， 方法原理與本方法基本相同， 只是前處理及收集雷氏鹽方 法有所差異。本方法研究借鑒于營養(yǎng)學報1993年 6 月第 15卷第 2 期上發(fā)表的論文嬰 兒奶粉集食品中膽堿的測定 。經(jīng)過大量試驗，進一步完善了實驗條件，形成了0-5mg/mL,線性回現(xiàn)在的測定方法。在本實驗條件下，測定膽堿的線性范圍為 歸方程 y=1.661400e-02+3.86303e*x ；相關系數(shù)為 0.9992 。本方法與國標中方法 相對照得到滿意的結果。

6、 該方法與原國標中的方法進行了比對實驗， 通過對兩方 法測定結果進行的統(tǒng)計分析表明：兩者測定結果見無顯著差異。5 標準主要條款的說明5.1 范圍適用于嬰幼兒配方食品和乳粉中膽堿的測定。5.2 方法原理食品中的膽堿包括游離態(tài)和結合態(tài)兩種形態(tài)， 用氫氧化鋇甲醇氯仿混合 溶液抽提水解 樣液經(jīng)過弗羅里硅藻土層析， 與水解產(chǎn)物分離， 在柱子上與雷納 克銨鹽溶液形成粉紅色的膽堿雷納克鹽，用丙酮溶解洗脫，于 526nm 測定吸收 值5.3 樣品處理膽堿在奶粉及米粉樣品中主要以磷酸膽堿和乙酰膽堿的形式存在， 而強化膽 堿主要以氯化膽堿的形式存在。 首先要經(jīng)過水解， 水解的作用就是要使結合態(tài)的 膽堿游離出來。稱

7、取10g左右的樣品于磨口三角瓶中，加入 50ml氫氧化鋇一甲 醇氯仿抽提液，上接冷凝管，在 79 2C的水浴鍋內(nèi)水解4小時，不時地搖動三角瓶，使樣品不結塊.水解溫度是樣品前處理的關鍵控制點， 因為水解溫度會 直接影響水解效果。溫度過低容易使樣品水解不充分； 溫度過高，又會因膽堿的 不穩(wěn)定性使其分解損失，造成結果偏低。所以要嚴格控制水浴溫度，要選用恒溫 控制良好的水域鍋。5.4實驗使用試劑 541膽堿標準品本實驗使用的膽堿標準品沒有采用氯化膽堿。主要是因為氯化膽堿極易吸 潮，遇熱不穩(wěn)定，故采用酒石酸膽堿作標準品。酒石酸膽堿性質穩(wěn)定，在配制使 用過程中基本無變化，且含有的極少量水分，放在干燥器中2

8、小時以上即可除去。該標樣要現(xiàn)用現(xiàn)配。5.4.2雷氏鹽雷氏鹽全名為雷納克銨鹽(Ammonium Reineckate)。該試劑要求純度要高,否則對顯色會產(chǎn)生干擾。該試劑需要現(xiàn)用現(xiàn)配。5.4.3層析柱層析柱的填料為弗羅里硅藻土( 60120 目)，且經(jīng)過650r活化后的吸附 效果好。層析柱只能一次性使用。5.5標準曲線的繪制從1g/L的膽堿標準工作液中，分別吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，注入層析柱中，按樣液層析步驟，收集粉紅色的膽堿雷納克鹽丙酮標準溶液并定溶于10ml。以丙酮為空白，在526nm處測定其吸光值。以膽堿含量為橫座標，吸光 值為縱座標，繪制標準曲線。膽堿標準曲線及吸

9、光值回歸方程與相關系數(shù)膽堿含量mg0.991.982.973.964.95吸光值0.05380.09580.12840.17180.207回歸方程y=1.661400e-02+3.86303e*x相關系數(shù)rr= 0.999230由此可見在一定膽堿濃度為0-5mg/mL內(nèi)符合比爾定律。5.6結果分析與計算0.474。即通過從工作曲線上查得樣液中膽堿的含量， 可計算出試樣中膽堿的含量。注 意若以酒石酸膽堿作來來表示標準溶液濃度時，與膽堿的換算系數(shù)為 最終結果應以膽堿表示。5.7最低檢出險根據(jù)GB/T5009.1-2003，中A 2.2吸光法和熒光法中的計算方法。計算檢出限:Xl-X Ks L =

10、= T式中：b標準曲線回歸方程中的斜率。S二次空白值的標準偏差；K根據(jù)一定置信度確定的系數(shù),按3計算。確認試樣檢出限為5mg/100g。5.8準確度的計算為了確定本方法的準確度,根據(jù)GB/T5009.1-2003，我們選用了三個不同水平的奶粉樣品作回收率試驗。實驗室水平本底值(mg/100g)添加量（mg實測值（mg回收率（卩g）平均回 收率（卩g）國家乳制品質水平152.261010.51105.1量監(jiān)督檢驗中水平260.351514.3595.6798.80心水平370.123028.6995.636實驗室間方法驗證由于本標準含蓋了嬰幼兒配方方食品和奶粉，所以我中心根據(jù)方法驗證要 求，分別

11、制備嬰幼兒配方奶粉與嬰幼兒配方米粉各三個水平的樣品供實驗間方法 驗證。由于時間關系，只有兩家實驗室參加其驗證工作：青島圣元營養(yǎng)乳品有限 公司中心實驗室與國家乳制品質量監(jiān)督檢驗中心。驗證結果如下:6.1實驗室內(nèi)精密度青島圣元營養(yǎng)乳品有限公司中心實驗室膽堿測定結果編號水平奶粉米粉123456185.1692.9652.68122.5893.5570.82286.5295.7454.15118.5093.0773.15383.8093.0151.22126.6594.0370.11483.4494.1853.58124.6895.1871.56582.1891.8752.77120.8692.886

12、9.87687.2590.1754.02119.9894.7571.06平均值84.7392.9953.07122.2193.9171.10標準偏差1.941.911.093.050.921.18相對標準偏差%2.292.052.052.500.981.66國家乳制品質量監(jiān)督檢驗中心膽堿測定結果編號水平奶粉米粉123456187.1990.0150.35125.6895.2570.82289.2292.3050.36123.1593.2967.98384.4091.1453.00125.3594.9371.81487.1292.3252.05126.9898.8566.96586.0090.8

13、549.06127.0297.8169.97688.3592.2148.02129.6599.7965.56平均值87.0591.4750.47126.3196.6568.85標準偏差1.710.961.842.162.542.41相對標準偏差%1.961.053.651.712.623.506.2精密度的計算621測試結果一致性和離群值的檢驗:（依據(jù)GBT 6379.2-2004測量方法與結果的準確度 第2部分確定標準測量方法重復性與再現(xiàn)性的基本方法 計算。從以上兩個實驗室的八個數(shù)據(jù)中取前六個數(shù)據(jù)進行計算。表1膽堿測定原始數(shù)據(jù)mg/100g實驗室測定次數(shù)水平123456青島圣元營養(yǎng)乳品有限公

14、司中心實驗室（1）185.1692.9652.68122.5893.5570.82286.5295.7454.15118.5093.0773.15383.8093.0151.22126.6594.0370.11483.4494.1853.58124.6895.1871.56582.1891.8752.77120.8692.8869.87687.2590.1754.02119.9894.7571.06國家乳制品質量監(jiān)督檢驗中心（2）187.1990.0150.35125.6895.2570.82289.2292.3050.36123.1593.2967.98384.4091.1453.00125

15、.3594.9371.81487.1292.3252.05126.9898.8566.96586.0090.8549.06127.0297.8169.97688.3592.2148.02129.6599.7965.56實驗室i水平j奶粉米粉123456yijnijyijnijyijnijyijnijyijnijyijnij184.73692.99653.076122.21693.31671.106287.05691.47650.476126.31696.65668.856膽堿含量的單元平均值表2(ng/100g)表3膽堿含量的標準差室i123456SijnijSijnijSijnijSijni

16、jSijnijSijnij11.9461.9161.0963.0560.9261.18621.7160.9661.8462.1662.5462.416用柯克倫檢驗檢驗實驗數(shù)據(jù)是否有歧離值和離群值。根據(jù) GB/T6379.2 0047.321 中的規(guī)定:如果檢驗統(tǒng)計量小于或等于5%臨界值，則接受檢驗的項目為正確值;如果檢驗統(tǒng)計量大于 5%臨界值，但小于或等于1%臨界值，則稱被檢驗的項目為歧離值。但可參與計算。如果檢驗統(tǒng)計量大于 1%的臨界值，則被檢驗的項目稱為立群值。予以剔除。在本實驗中，P=2,n=6柯克倫檢驗1%臨界值為0.937， 5%臨界值為0.877?？驴藗悪z驗統(tǒng)計量:CSmax=PT

17、* 2送S表4柯克倫統(tǒng)計量計算值:水平P2乞s2s實驗室柯克論統(tǒng)計量16.68773.7636實驗室10.56324.56973.6481實驗室10.79934.57373.3856實驗室20.738413.96819.3025實驗室10.66557.29806.4516實驗室20.88467.20055.8081實驗室20.807由此可知只有水平 5實驗室2的數(shù)據(jù)為歧離值，其它檢驗數(shù)據(jù)均為正確值， 均可參與數(shù)據(jù)統(tǒng)計。6.2.2 r?j，srj 和 sRj 的計算6.2.2.1總平均值m的計算 以水平1為例水平 1:r?j = yj =6.2.2.2方差的計算ps nij yij弋=85.89

18、Z niji 4根據(jù) GB/T6379.2-2004中 7.4.4和7.4.5中所定義的諸方差計算以水平1為例:重復性方差:PZ (nij -1)Si2i-=3.344p送(nij 1)i 二實驗室間方差:Sj2njnj1 i P -1 yf1pziz1 sdj - Sr2nijWij -y)2 =16.147nijPZ njyp送nijiT=6Si216-143-34 2.134重復性標準差Sr =1.829再現(xiàn)性方差:SRj =s2 弋=3.344 + 2.134 = 5.478再現(xiàn)性標準差Sj =2.341依次對水平2、3、4、5、6進行計算，其結果見表5 6.2.3精密度與m的關系表5樣品中的膽堿含量r?j, Srj和SRj的值水平jPjmjSrjSRj1285.891.8