熒光定量PCR在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

1、熒光定量PCR在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用    摘要：熒光定量PCR是一種新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)在PCR儀反應(yīng)系統(tǒng)中引入了熒光標(biāo)記探針，通過(guò)熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，使PCR擴(kuò)增和終產(chǎn)物檢測(cè)全處在封閉的條件下進(jìn)行，從而具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、無(wú)污染、快速、靈敏、精確、特異等特點(diǎn)，極大的克服了原有     摘要：熒光定量PCR是一種新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)在PCR儀反應(yīng)系統(tǒng)中引入了熒光標(biāo)記探針，通過(guò)熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，使PCR擴(kuò)增和終產(chǎn)物檢測(cè)全處在封閉的條件下進(jìn)行，從而具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、無(wú)污染、快速、靈敏、精

2、確、特異等特點(diǎn)，極大的克服了原有PCR儀技術(shù)的不足，其最主要的優(yōu)勢(shì)是能對(duì)待測(cè)樣本起始PCR反應(yīng)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，擴(kuò)大了PCR的應(yīng)用范圍，熒光定量PCR已廣泛用于生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，近年來(lái)其在中醫(yī)藥研究中得到越來(lái)越多的應(yīng)用。 關(guān)鍵詞：熒光定量PCR;中醫(yī)藥;應(yīng)用 中圖分類(lèi)號(hào)：R2-03 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-7717(2008)04-0758-03 熒光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q PCR)，又稱(chēng)實(shí)時(shí)定量（real-time quantitative）PCR，F(xiàn)Q PCR是在PCR技

3、術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司首先推出。它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板濃度進(jìn)行定量分析。它的特點(diǎn)是：（1）用產(chǎn)生熒光信號(hào)的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量。（2）熒光信號(hào)通過(guò)熒光染料嵌入雙鏈DNA，或雙重標(biāo)記的序列特異性熒光探針或能量信號(hào)轉(zhuǎn)移探針等方法獲得，大大提高了檢測(cè)的靈敏度、特異性和精確性。（3）進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)的熒光檢測(cè)，消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無(wú)復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過(guò)程。與傳統(tǒng)的PCR相比，實(shí)時(shí)定量PCR更加快速、靈敏，并能有效地減少試驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生污染的

4、危險(xiǎn)1。 熒光定量PCR的出現(xiàn)克服了傳統(tǒng)PCR技術(shù)普遍存在的假陽(yáng)性及不能定量等問(wèn)題，使得PCR技術(shù)更廣泛的應(yīng)用于臨床，在監(jiān)測(cè)患者病情、預(yù)后、指導(dǎo)用藥等方面有著廣闊的應(yīng)用前景2。熒光定量PCR也越來(lái)越多地被應(yīng)用于中醫(yī)藥的研究，為中醫(yī)藥理論及其臨床研究提供了更為客觀的物質(zhì)基礎(chǔ)。 1熒光定量PCR在中醫(yī)藥防治乙肝中的應(yīng)用 1.1對(duì)乙肝的中醫(yī)辨證分型客觀化 量化的探索確定證型是中醫(yī)辨證施治的前提，雖然對(duì)慢性乙肝的中醫(yī)辨證分型已作了統(tǒng)一規(guī)范，但這些規(guī)范仍停留在傳統(tǒng)的望、聞、問(wèn)、切上，缺乏統(tǒng)一的量化和客觀公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，給大規(guī)模的臨床研究和實(shí)施循證醫(yī)學(xué)帶來(lái)許多困難。因此，探索慢性乙肝中醫(yī)證型與客觀監(jiān)測(cè)指標(biāo)間的關(guān)

5、系，不僅是中醫(yī)現(xiàn)代化的要求，也成為中西醫(yī)結(jié)合的熱點(diǎn)3。 有學(xué)者觀察慢性乙肝患者乙肝病毒（HBV）復(fù)制與中醫(yī)證型關(guān)系，發(fā)現(xiàn)實(shí)證較虛證活躍，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者易發(fā)生HBV前C區(qū)突變，而以濕熱中阻型乙肝易發(fā)生，脾腎陽(yáng)虛型乙肝不易發(fā)生，表明實(shí)證者細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)。 而另有人研究發(fā)現(xiàn)HBV-DNA按肝郁脾虛、濕熱中阻、竅血阻絡(luò)、肝腎陰虛依次遞增。新近的研究表明，乙肝病毒可以分為A、B、C、D、E、F、G、H等若干基因型。在乙肝病毒治療過(guò)程中，通常伴隨著HBV病毒的基因型及血清學(xué)的轉(zhuǎn)換。研究發(fā)現(xiàn)，基因型的分布與人群和地理位置有關(guān)。如在香港地區(qū)被證實(shí)屬于B型或C型，而在瑞士主要為A型到E型以A型和D

6、型最多。同時(shí)不同基因型的乙肝病毒對(duì)所用治療藥物的敏感性也有差異3。楊麗莎等4研究表明乙肝患者濕熱滯留型HBV-DNA含量在5×1065×109CPS/mL的濃度比例最多，正虛邪戀HBV-DNA含量在5×1035×105CPS/mL的濃度比例最多，HBV-DNA含量低于濕熱滯留，而高于無(wú)癥狀攜帶組，在乙肝病毒含量檢測(cè)項(xiàng)目中異常變化順序是濕熱滯留>正虛邪戀>癥狀攜帶，可見(jiàn)病毒含量的濃度與濕熱輕重密切相關(guān)，濕熱含量越重者病毒含量越高。而徐秋英等5觀察發(fā)現(xiàn)HBV-DNA按濕熱中阻、肝腎陰虛、脾虛肝郁、脾腎陽(yáng)虛、郁血阻絡(luò)依次遞減。 根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)，筆者在

7、研究乙肝證型規(guī)范化時(shí)，若采用熒光定量PCR的方法，并結(jié)合乙肝的血清學(xué)標(biāo)志及基因型標(biāo)志，很可能對(duì)乙肝各證型的科學(xué)內(nèi)涵做出更為明確的解釋。 1.2在乙肝的診斷和治療中的價(jià)值中草藥抗病毒作用眾所周知，但由于酶免法檢測(cè)乙肝標(biāo)志物不能真實(shí)地反映患者體內(nèi)乙肝病毒的復(fù)制情況，在觀察乙型肝炎療效方面缺乏量化的指標(biāo)，而乙型肝炎熒光定量PCR檢測(cè)可以對(duì)乙肝病毒的復(fù)制水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，根據(jù)患者血清HBV-DNA的拷貝數(shù)進(jìn)行辨證分型，同時(shí)預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)中草藥及干擾素的治療效果，對(duì)臨床有重要指導(dǎo)意義5。 傳統(tǒng)的酶免法檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物檢測(cè)的靈敏度一般需要1057個(gè)病原體，熒光定量PCR檢測(cè)的靈敏度則可達(dá)到0.01fg，相當(dāng)

8、于2.5個(gè)HBV-DNA顆粒。酶免法檢測(cè)的是乙肝抗原抗體系統(tǒng)，在特異抗體產(chǎn)生之前，乙肝病毒就已出現(xiàn)在外周血中，但在血液中無(wú)法檢測(cè)到，這樣就出現(xiàn)了一個(gè)免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”問(wèn)題，從而不能真實(shí)地反映患者體內(nèi)乙肝病毒的復(fù)制情況。熒光定量PCR是直接從血液中檢測(cè)乙肝病毒DNA，這就解決了免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”問(wèn)題，從而判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)或者是現(xiàn)癥感染還是既往感染5。 在療效觀察上不能以單純的HBeAg抗原的消失或臨床癥狀的改善和消失為判定依據(jù)，在治療的一些肝炎病例中，采用免疫測(cè)定法檢測(cè)到HBsAg為陽(yáng)性，而HBeAg為陰性者，不被確診為乙肝活動(dòng)期，預(yù)后也不存在轉(zhuǎn)陰問(wèn)題。然而患者的癥狀與乙

9、型肝炎癥狀相似，通過(guò)中藥治療后患者大多數(shù)好轉(zhuǎn)，有的甚至痊愈。究竟這些患者是否乙肝活動(dòng)期、有沒(méi)有HBV-DNA，經(jīng)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)HBeAg陰性攜帶者存在病毒復(fù)制具有傳染性，因此，血清轉(zhuǎn)化并不能說(shuō)明HBV的消除及感染性的喪失。這也說(shuō)明中藥對(duì)乙肝有確切的療效，它通過(guò)中和乙肝病毒，抑制其復(fù)制，并能及時(shí)清除抗原-抗體復(fù)合物，從而達(dá)到疏肝、清肝、瀉肝、平肝、鎮(zhèn)肝、養(yǎng)肝、柔肝、溫肝的治療作用6。 利用熒光定量PCR技術(shù)，可直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中的HBV-DNA存在的情況，這對(duì)確定患者血液的感染性，乙肝病毒持續(xù)感染中疾病的活動(dòng)情況，進(jìn)而采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施，以及對(duì)中藥抗病毒藥物療效的評(píng)價(jià)，都具有非常重

10、要的意義。 2熒光定量PCR在評(píng)價(jià)中醫(yī)藥抗病毒療效中的應(yīng)用 近些年越來(lái)越多的把熒光定量PCR運(yùn)用于評(píng)價(jià)中藥或復(fù)方在抗病毒方面作用的研究中，進(jìn)一步地明確了中藥的治療效果和作用機(jī)制，使中醫(yī)藥的作用得到更為客觀、定量的體現(xiàn)。 范瑞強(qiáng)等7在探討中藥抗病毒膠囊治療生殖器皰疹的研究中運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)豚鼠生殖道單純皰疹病毒（HSV）2型的含量，發(fā)現(xiàn)抗病毒膠囊可以減少脊髓神經(jīng)節(jié)HSV-2DNA的含量。蔡有齡等8考察中藥“疣毒清”對(duì)尖銳濕疣病毒（HPV）的殺滅作用發(fā)現(xiàn)，在提取的HPV中加入中藥“疣毒清”后，在4下孵育，按時(shí)提取HPV-DNA，用熒光定量PCR法測(cè)定其病毒含量，經(jīng)24h后即不能測(cè)出HPV，證

11、實(shí)“疣毒清”具有明確的殺滅HPV的作用，找到了其在臨床上單純口服即能治愈尖銳濕疣且不再?gòu)?fù)發(fā)這一事實(shí)的機(jī)理。李蕓茜等9探討黃芪顆粒劑對(duì)剛地弓形蟲(chóng)RH株速殖子感染小鼠的治療作用，用熒光定量PCR檢測(cè)肝、肺弓形蟲(chóng)DNA基因拷貝數(shù)，通過(guò)比較各組小鼠的平均存活時(shí)間發(fā)現(xiàn)黃芪可以改善低劑量速殖子小鼠的存活情況。童光東等10通過(guò)對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)觀察，證明加味四逆散具有一定的抑制其血清中與肝組織中HBV-DNA的作用。吳建軍等11研究雙黃連粉針劑對(duì)人巨細(xì)胞病毒（HCMV）感染的小鼠肝組織病毒DNA載量的影響，實(shí)驗(yàn)表明雙黃連能明顯降低感染小鼠肝組織中病毒DNA載量，能減輕HCMV型肝炎模型鼠肝功能損害，改

12、善肝臟病理變化。李薇等12探討中藥雙黃連注射液對(duì)人胚腦單純皰疹病毒型腦炎模型的抑毒作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)雙黃連可通過(guò)減少病毒DNA的復(fù)制，對(duì)單純皰疹病毒型腦膜炎模型的病變起到抑制病毒的作用。 3熒光定量PCR在中醫(yī)藥引起基因表達(dá)變化作用中的應(yīng)用 俞建等13研究滋陰瀉火中藥對(duì)青春期大鼠中樞生長(zhǎng)相關(guān)基因的影響，設(shè)立對(duì)照組，采用熒光定量PCR法，檢測(cè)不同劑量中藥對(duì)于青春期大鼠下丘腦及垂體部分生長(zhǎng)相關(guān)基因的影響。結(jié)果滋陰瀉火中藥對(duì)于下丘腦促生長(zhǎng)激素釋放抑制激素(SRIH)基因表達(dá)，中、大劑量治療組顯著增高，表明其可能通過(guò)上調(diào)SRIH基因表達(dá)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素分泌，從而對(duì)青春期大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育起到一定的抑制影響。王琳等

13、14應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法研究復(fù)方861對(duì)人肝星狀細(xì)胞（LX-2）中-平滑肌肌動(dòng)蛋白（-SMA）基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，復(fù)方861在48和72h后可顯著降低LX-2細(xì)胞中-SMA mRNA含量，提示其抗纖維化作用可能與抑制LX-2細(xì)胞的活化有關(guān)。張黎等15研究何首烏水溶性成分2，3，5，4-四羥基二苯乙烯2-D葡糖苷（STI）對(duì)溶血磷脂酰膽堿(LPC)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響，用熒光定量PCR檢測(cè)STI使VEGF mRNA表達(dá)成劑量依賴(lài)性降低，說(shuō)明對(duì)其有明顯抑制作用，基于VEGF與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性，從而STI可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化

14、的預(yù)防及治療有良好的開(kāi)發(fā)前景。張榮華等16觀察益骨膠囊預(yù)防和治療用藥對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中的骨重建關(guān)鍵性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-）的影響，通過(guò)檢測(cè)TGF-1mRNA含量，在分子水平上闡明益骨膠囊防治骨質(zhì)疏松癥的可能作用機(jī)制，結(jié)果益骨膠囊能促進(jìn)骨組織TGF-1mRNA基因表達(dá)。張永芳等17探討知母活性成分ZDY101對(duì)M2受體mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZDY101能提高M(jìn)2受體mRNA的穩(wěn)定性，使細(xì)胞M2受體的mRNA含量升高，ZDY101可用于阿爾茨海默病的治療。楊禮騰等18運(yùn)用熒光定量PCR等研究表明，冬蟲(chóng)夏草的發(fā)酵粉末對(duì)肺纖維化膠原代謝有明顯的調(diào)控作用，其作用機(jī)制可能為抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)

15、因子TGF-1mRNA表達(dá)的上調(diào)，從而干擾TGF-smads信號(hào)通路對(duì)靶基因的激活而實(shí)現(xiàn)的。朱昭明等19研究通腎絡(luò)1號(hào)對(duì)高糖狀態(tài)下大鼠腎系膜細(xì)胞金屬蛋白酶2（MMP-2）及其抑制物2mRNA(TIMP-2mRNA)的影響，運(yùn)用熒光定量PCR法及ELISA法檢測(cè)MMP-2、TIMP-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平及細(xì)胞培養(yǎng)上清產(chǎn)物FN、ColIV（二者為細(xì)胞外基質(zhì)主要成分）的含量，結(jié)果表明通腎絡(luò)1號(hào)可降低細(xì)胞上清FN、ColIV含量，這種作用是通過(guò)提高M(jìn)MP-2mRNA水平，降低TIMP-2mRNA水平，達(dá)到升高M(jìn)MP-2/ TIMP-2比值實(shí)現(xiàn)的。這一研究進(jìn)一步明確了糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制及通腎絡(luò)1號(hào)的治療

16、作用。 4熒光定量PCR在舌診研究中的應(yīng)用 許冬青等20采用基因芯片及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究舌癌患者不同舌苔舌背黏膜上皮細(xì)胞表皮。生長(zhǎng)因子受體（EGF-R）表達(dá)的差異，以期從基因分子水平探討不同舌苔形成機(jī)理，為中醫(yī)診斷現(xiàn)代化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)果表明，不同舌苔上皮細(xì)胞EGF-R基因表達(dá)水平存在明顯差異，EGF-R可能是影響舌苔形成的重要因素之一。已有報(bào)道，不同舌苔的形成與舌上皮細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)及細(xì)胞生化代謝等有關(guān)，說(shuō)明舌苔變化可能是多基因聯(lián)合調(diào)控的結(jié)果，其機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。 5結(jié)語(yǔ) 綜上所述，熒光定量PCR作為一種新的核酸定量技術(shù)，在以前的PCR技術(shù)基礎(chǔ)上得到進(jìn)一步發(fā)展，大大降低了假陽(yáng)性

17、率，工作效率高，結(jié)果重現(xiàn)性好，而且不必使用對(duì)人體有害的染色劑。在中醫(yī)藥迫切需要得到進(jìn)一步發(fā)展的今天，熒光定量PCR技術(shù)已越來(lái)越多在中醫(yī)藥研究中得到應(yīng)用，除上述應(yīng)用外，熒光定量PCR還可進(jìn)一步運(yùn)用于對(duì)中醫(yī)證實(shí)質(zhì)的研究及構(gòu)建中醫(yī)證的相關(guān)基因表達(dá)圖譜，用于探討中醫(yī)經(jīng)絡(luò)現(xiàn)象和針灸的作用機(jī)理以及對(duì)中藥材進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，熒光定量PCR必將不斷擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域。隨著PCR技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的廣泛應(yīng)用，它將極大的促進(jìn)中醫(yī)藥的發(fā)展，為中醫(yī)學(xué)走向世界、走向現(xiàn)代化作出貢獻(xiàn)。 參考文獻(xiàn) 1蔡霞.定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用現(xiàn)狀J.現(xiàn)代診斷與治療，2005，16（2）：112-115. 2鄧少麗，羅陽(yáng)，陳偉.熒光定量PCR

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