抗表皮生長因子受體單克隆抗體在膠質(zhì)瘤導(dǎo)向治療的實(shí)驗(yàn)研究

1、抗表皮生長因子受體單克隆抗體在膠質(zhì)瘤導(dǎo)向治療的實(shí)驗(yàn)研究費(fèi)智敏張尚權(quán)王勇邱永明王宇金萍茜羅其中 目的 觀察同位素標(biāo)記的抗表皮生長因子單克隆抗體EQ75對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的親和力及殺傷力。方法 體外實(shí)驗(yàn)：采用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀熒光強(qiáng)度定量分析進(jìn)行EQ75對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株BT325表面抗原特異性鑒定。體內(nèi)試驗(yàn)：建立裸小鼠移植性膠質(zhì)瘤模型，隨機(jī)分組，經(jīng)尾靜脈分別注入111In-EQ75和111In-IgG，48 h后測定各臟器組織T/NT放射性比值，連續(xù)2周觀測腫瘤移植物的大小，比較荷瘤小鼠的生存時(shí)間。結(jié)果 體外試驗(yàn)：EQ75對BT325有高度的親和性。體內(nèi)試驗(yàn)：EQ75組T/NT、腫瘤移植物的抑制率以

2、及荷瘤小鼠的生存時(shí)間均高于對照組(P0.01)。 結(jié)論 111In-EQ75對膠質(zhì)瘤細(xì)胞有良好的親和力及殺傷力。 關(guān)鍵詞 膠質(zhì)瘤 放射免疫測定 免疫療法 抗體，單克隆 表皮生長因子受體 EXPERIMENTAL RADIOIMMUNOTHERAPY OF GLIOMA USING 111In-LABELED MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR Fei Zhimin, Zhang Shangquan, Wang Yong, et al. Department of Neurosurgery, RenjiHosp

3、ital, Shanghai Second Medical University 200001 Objective：To observe affinity and tumoricidal power of monoclonal antibody EQ75 to epidermal growth factor receptor on glioma cells.Methods：In vitro binding specificity of EQ75 was studied with fluoromicroscope and FACs. In vivo nude mice bearing BT325

4、 glioma xenografts were injected with either 111In-EQ75 or 111In-IgG intravenously. Specific activity ratios in tumors compare to normal mouse tissue (T/NT) were determined at 2nd day following antibody injection. The volumes of tumor xenografts were measured for 2 weeks consecutively. The survival

5、time of the nude mice in 111In-EQ75 group was compared to the control group.Results：111In-EQ75 showed a high affinity to BT325 target cells. The tumor growth inhibitory rate and T/NT in nude mice treated with 111In-EQ75 were significantly higher than the control group (P0.01). The survival time was

6、prolonged than the control group (P0.01).Conclusion：This study demonstrated that 111In-EQ75 showed a good affinity and tumoricidal power against glioma. Key words Antibodies, monoclonal Immunotherapy Glioma Receptors, epidermal growth factor Radioimmunodetection 1984年，Libermann等1首次證實(shí)，多種腦部腫瘤的細(xì)胞表面過度表達(dá)

7、表皮生長因子受體(EGFr)。1987年，Takahashi等2發(fā)現(xiàn)EGFr在膠質(zhì)瘤中過度表達(dá)，其表達(dá)率高出正常腦組織近100倍。1992年，Jaros等3認(rèn)為膠質(zhì)瘤的預(yù)后與EGFr的數(shù)量增多有關(guān)，而且EGFr的表達(dá)率與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面EGFr過度表達(dá)的特性，使得利用EGFr單克隆抗體作為導(dǎo)向載體成為可能。本研究通過體外及同位素標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，以了解其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的親和力及殺傷力，為臨床診斷膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)及其免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法 一、實(shí)驗(yàn)動物 裸小鼠BALB/c，鼠齡46周，體重18 g22 g，雌雄兼用。 二、實(shí)驗(yàn)材料 人腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系

8、BT325，配制含瘤細(xì)胞數(shù)5107/ml混懸液備用。 三、膠質(zhì)瘤裸鼠模型的建立 注射器吸取瘤細(xì)胞混懸液0.1 ml(5106/0.1 ml)注射于裸小鼠的左側(cè)腋部皮下。共移植裸小鼠60只，待腫瘤體積長至1 cm3時(shí)，隨機(jī)分成6組，每組10只待用。 四、單抗制備及同位素交聯(lián) EQ75由中科院上海細(xì)胞所提供(用表皮癌細(xì)胞株A431免疫小鼠后制備成單抗，已作專一性分析及鑒定4)，單抗屬小鼠IgG1，所針對的抗原位于細(xì)胞膜表面的EGFr，經(jīng)高壓液相Hitrap Protein G柱分離純化，標(biāo)記的單抗經(jīng)0.22 m濾膜過濾除菌。兔抗鼠正常IgG作為對照組。 五、EQ75單抗的免疫熒光鑒定對BT325(

9、5105/管)加入50 l EQ75單抗細(xì)胞株培養(yǎng)上清，及加入非相關(guān)性抗體作為對照組，30 min 4 ，洗滌后加羊抗鼠IgG-FITC，30 min 4 ，洗滌后經(jīng)熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀(美國，Becton-Dickinson公司FACStarplus型)熒光強(qiáng)度定量分析。 六、體內(nèi)實(shí)驗(yàn) A1、A2、A3組：每鼠尾靜脈注射111In-EQ75各0.1 ml，B1、B2、B3組：每鼠尾靜脈注射111In-IgG各0.1 ml。 七、觀察指標(biāo) 1.腫瘤顯像 于注入示蹤劑后2、4 h行照相，工作條件取窗寬10%，高能平行孔準(zhǔn)直器，總計(jì)數(shù)100 K。 2.標(biāo)記抗體的體內(nèi)分布 測定全身放射性計(jì)數(shù)后，在

10、48 h，分別將A1和B1組動物處死，取腫瘤、血液、內(nèi)臟器官及肌肉組織，分別測其放射性，以推算腫瘤與非腫瘤組織的放射性比值(T/NT)。 3.腫瘤生長抑制率 連續(xù)2周用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑(a)和短徑(b)，按公式(1)計(jì)算腫瘤體積(v)，繪制2周內(nèi)A2、B2組裸鼠腋下腫瘤大小變化曲線，并于2周后處死動物，剝?nèi)∧[瘤標(biāo)本，按公式(2)計(jì)算腫瘤生長抑制率。 V=a.b2/2(1) (2) 4.生存時(shí)間 比較A3和B3兩組小鼠自接受治療之時(shí)起至自然死亡的天數(shù)。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以上數(shù)據(jù)經(jīng)Student T及Wilcoxon檢驗(yàn)處理。 結(jié)果 一、熒光顯微鏡下可見：膠質(zhì)瘤細(xì)胞周圍有熒光素聚集。 二、EQ

11、75單抗與BT325表面抗原特異性鑒定，經(jīng)流式細(xì)胞分離儀熒光分析為陽性(見圖1)。 圖1 EQ75單抗與BT325表面抗原特異性鑒定 對照組、實(shí)驗(yàn)組的靶細(xì)胞BT325分別為5104 ml，對照組加入非相關(guān)性抗體Tac，實(shí)驗(yàn)組加入EQ75細(xì)胞株培養(yǎng)上清，然后分別加入羊抗鼠IgG-FITC，流式細(xì)胞儀檢測，BT325顯示陽性。 三、2 h 照相顯示：A組荷瘤小鼠左側(cè)腋下腫瘤及膀胱顯像，4 h后腋下腫瘤影像進(jìn)一步增強(qiáng)，而B組荷瘤小鼠僅見膀胱影像，腫瘤區(qū)未見顯影。 四、48 h后A1、B1組T/NT有高度顯著差異(見表1)，A1組的各組織中放射活性物質(zhì)的吸附率見表2。 表1 48 h后A1、B1組各臟

12、器組織的T/NT放射性比值 A1組 B1組 血 2.1520.398* 1.3440.241 心 2.9810.560* 2.3440.511 肺 1.3570.356* 0.8400.788 肝 0.3610.109* 0.2100.065 腎 0.0920.014* 0.0540.030 脾 0.4100.144* 0.1720.042 骨 2.3171.578* 0.4240.224 肌 2.3071.510* 0.8330.794 *P0.01 表2 48h A1組各組織中的放射活性物質(zhì)的吸附率(%) 腫瘤 血 心 肺 肝 腎 脾 骨 肌 吸附率(%) 1.66 0.43 0.06 0

13、.12 0.06 0.18 0.10 0.06 0.04 五、動態(tài)觀察腫瘤體積的大小變化(見圖2)。計(jì)算其腫瘤生長抑制率，經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)：A2組明顯高于B2組(P0.01)。 圖2 2周內(nèi)A2、B2組裸鼠移植性腫瘤體積的變化曲線 六、A3、B3兩組小鼠生存時(shí)間曲線顯示：A3組明顯延長。生存時(shí)間曲線見圖3。 圖3 A3、B3兩組荷瘤小鼠分別于尾靜脈注射111In-EQ75和111In-IgG各0.1 ml，小鼠生存時(shí)間曲線顯示：A3組明顯長于B3組。 討論 惡性腫瘤的導(dǎo)向治療，即以親腫瘤物質(zhì)為載體，有細(xì)胞毒作用的物質(zhì)作彈頭，使后者能較多殺傷腫瘤而較少損傷正常組織細(xì)胞。早在100年前，就有

14、人提出了“魔彈”的概念，但因各種載體、彈頭的制備以及交聯(lián)技術(shù)的限制，導(dǎo)向治療的進(jìn)展緩慢；近10年來，由于單克隆技術(shù)、基因工程以及交聯(lián)技術(shù)的介入，導(dǎo)向治療有了空前的發(fā)展，國內(nèi)有學(xué)者5，6曾成功地將其應(yīng)用于肝癌治療，但在治療膠質(zhì)瘤方面仍是一個(gè)空白。 隨著CT及MRI的普及，腦瘤的檢出率正呈逐年增高的趨勢，作為顱內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤棗膠質(zhì)瘤約占腦瘤總數(shù)的45%，全國每年有6萬個(gè)以上的膠質(zhì)瘤新發(fā)病例。雖然外科手術(shù)及放化療技術(shù)在過去的10年中均有長足的進(jìn)步，但傳統(tǒng)的治療方法仍無法改變膠質(zhì)瘤的預(yù)后，其中位生存期僅為69周。術(shù)后放療有助于延長此類患者的平均生存期710，但是大劑量的放射治療在控制局部病灶的

15、同時(shí)，往往會導(dǎo)致致命的放射性腦壞死及放射性腦病11。膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)EGFr的特性，使得其作為導(dǎo)向載體成為可能。 本組資料中EQ75熒光顯影及流式細(xì)胞儀熒光強(qiáng)度定量分析結(jié)果提示：EQ75在體外試驗(yàn)中與膠質(zhì)瘤細(xì)胞株BT325之間有高度的親和性。 體內(nèi)分布試驗(yàn)(包括照相及T/NT)測定結(jié)果表明：在移植于裸鼠的膠質(zhì)瘤組織中，EQ75的含量明顯地高于對照組IgG，EQ75對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的親和力極高，完全能鑒別膠質(zhì)瘤和正常組織，而對照組IgG則無此功能。EQ75能抑制人膠質(zhì)瘤移植物的生長，而且111In-EQ75在對腫瘤移植物的生長起抑制作用的同時(shí)，對周圍其他正常器官組織的放射性損傷較小，體現(xiàn)了11

16、1In-EQ75在導(dǎo)向治療中有良好的選擇性。由于EGFr作為膜抗原不易發(fā)生抗原調(diào)變、脫落或表達(dá)的異質(zhì)性，因而不會導(dǎo)致療效降低或治療無效。而且，同位素111In是近年來優(yōu)良放射源的代表，111In與抗體交聯(lián)物在靶細(xì)胞內(nèi)滯留時(shí)間為125的5倍，給藥后7天仍可殘留50%，持續(xù)殺傷時(shí)間較長12。A3與B3兩組小鼠的生存時(shí)間曲線顯示：111In-EQ75能明顯地延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間。 綜上所述：EQ75是一種優(yōu)良的導(dǎo)向載體，與同位素111In交聯(lián)物能抑制人膠質(zhì)瘤移植物在裸鼠體內(nèi)的生長，從而達(dá)到延長裸鼠生存時(shí)間的目的。本實(shí)驗(yàn)通過體外及同位素標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，以了解其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的親和力及殺傷

17、力，為今后過渡到臨床上診斷治療膠質(zhì)瘤提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。 *本課題獲上海市教委資助 第一作者簡介 費(fèi)智敏，男，學(xué)士，主治醫(yī)師。 作者單位：費(fèi)智敏王勇邱永明王宇金萍茜羅其中上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)外科(上海 200001) 張尚權(quán)中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所 參考文獻(xiàn) 1 Libermann TA, Razon N, Bartal AD, et al. Expression of epidermal growth factor receptors in human brain tumors. Cancer Res, 1984,44:753 2 Takahashi H, Herlyn D,

18、Atkinson B, et al. Radioimmuno-detection of human glioma xenografts by monoclonal antibody to epidermal growth factor receptor. CancerRes, 1987,47:3847 3 Jaros E, Perry RH, Adam L，et al. Prognostic implications of p53 protein, epidermal growth factor receptor, and Ki-67 labelling in brain tumors. Br J Cancer, 1992,66:373 4 張尚權(quán)，袁金輝，趙峰，等.抗表皮生長因子與抗CD3雙功能抗體的制備及細(xì)胞毒的研究.腫瘤，1997，17：355 5 施樂華，吳孟超，陳漢，等.抗人肝癌單克隆抗體對荷瘤裸鼠的放射免疫定位及治療。中華腫瘤雜志，1995，17：20 6 施樂華，吳孟超，陳漢，等.抗人肝癌單克隆抗體的人體放射免疫定位及治療。中華腫瘤雜志，1997，19：146 7 Dedparvar S, Krishna L, Miyamoto C，et al. Indium-111-Ia