表皮生長因子受體家族在翼狀胬肉上皮內(nèi)的異常表達

1、    表皮生長因子受體家族在翼狀胬肉 上皮內(nèi)的異常表達        【摘要】目的了解表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)家族的EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白在翼狀胬肉上皮內(nèi)的表達。方法用免疫熒光組織化學及Western blot方法對15例初發(fā)期翼狀胬肉患者切除的翼狀胬肉組織進行EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白的檢測，并與正常人結(jié)膜組織進行對照。結(jié)果免疫熒光組織化學染色顯示，在正常結(jié)膜上皮中，

2、EGFR蛋白可表達于基底層細胞表面，而ErbB2及ErbB3蛋白則表達于表層細胞。15例翼狀胬肉患者中，11例翼狀胬肉上皮的EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白均表達于翼狀胬肉上皮的全層，4例表達方式與正常結(jié)膜相似。Western blot檢測顯示，11例翼狀胬肉上皮EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白帶較正常結(jié)膜密度高。結(jié)論翼狀胬肉組織上皮EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白表達增加，提示翼狀胬肉可能是一組織增生性疾病，翼狀胬肉上皮EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白的異常表達及其與上皮下組織相互作用可能是翼狀胬肉發(fā)病的重要原因之一?！娟P(guān)鍵詞】翼狀胬肉；結(jié)膜；表皮生長因子；發(fā)病機制The a

3、bnormal expression of epidermal growth factor receptor family in pterygiumLIU Zuguo(Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060,China)XIE Yuhuan(Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060,China)ZHANG Mei, et

4、 al.(Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060,China)【Abstract】ObjectiveTo evaluate the expression of type 1 growth factor receptor family epidermal growth factor receptor (EGFR), ErbB2 and ErbB3 by the epithelium in pterygium so as to understand the p

5、athogenesis of this disorder. MethodsThe immunofluorescent staining and Western blotting were performed in 15 patients with primary pterygium, compared to normal conjunctival epithelium, to determine the expression of EGFR, ErbB2 and ErbB3 proteins. ResultsThe EGFR was present at the basal cells whi

6、le the ErbB2 and ErbB3 were expressed by the superficial cells in normal conjunctival epithelium in immunofluorescent staining. Of 15 pterygia, 11 pterygia expressed the stains of EGFR, ErbB2 and ErbB3 in the full thickness of epithelium and with stronger staining compared to the control group, 4 of

7、 them showed the same staining pattern as that in the normal conjunctiva. Compared to normal conjunctiva, the stronger density of protein bands of EGFR, ErbB2 and ErbB3 was also demonstrated by western blotting in 11 pterygia with strong staining of these antibodies. ConclusionsThe expression of EGF

8、R, ErbB2 and ErbB3 is increased in pterygium, showing that the pterygium is a disorder with proliferation. The abnormal expression of EGFR, ErbB2 and ErbB3 by epithelium and their communicating with cytokines at stroma in pterygium may be one of the key pathogenetic factors in this disorder.【Key wor

9、ds】Pterygium；Conjunctiva；Epidermal growth factor receptor；Pathogenesis翼狀胬肉是眼科較為常見的眼表面疾病之一，在赤道及陽光輻射高的地區(qū)其患病率較高1,2。翼狀胬肉組織向角膜中央生長可引起角膜散光而導致視力下降，如進入瞳孔區(qū)則嚴重影響視力。手術(shù)切除是治療此病的惟一方法，但其術(shù)后復發(fā)率較高3，可嚴重影響視力。目前的研究證明，紫外線是翼狀胬肉致病的最重要原因1,2,4-6，但其發(fā)病機制仍不十分清楚。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、ErbB2、ErbB3及ErbB4蛋白

10、為型生長因子受體家族的4個成員7,8，它們具有共同的分子結(jié)構(gòu)。以往的研究表明，EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白與細胞的增殖、移行及分化有密切的關(guān)系，并在其調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。宋建新和劉秋潤9發(fā)現(xiàn)EGFR、ErbB2及ErbB3在部分腫瘤組織中的陽性表達較高，因此目前認為其可能與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。翼狀胬肉臨床表現(xiàn)為新生的組織不斷生長，并向角膜浸潤，手術(shù)切除后易復發(fā)，這些特點與腫瘤組織相似。為了解翼狀胬肉上皮細胞的生物學特性，我們用免疫熒光組織化學及Western blot方法，對15例初發(fā)期翼狀胬肉患者的翼狀胬肉上皮中的EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白表達情況進行研究，并與

11、正常結(jié)膜組織進行比較，旨在為提供其發(fā)病機制的依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。材料與方法一、標本來源共收集本院門診15例初發(fā)期翼狀胬肉患者的手術(shù)標本，其中男性9例，女性6例；年齡2958歲。正常結(jié)膜12例，取自猝死尸體，均在死后12 h內(nèi)獲取。二、實驗材料EGFR、ErbB2及ErbB3單克隆抗體購自美國NeoMarker公司，熒光標記抗體購自美國Caltag Laboratories公司。三、實驗方法取15例翼狀胬肉及12例正常結(jié)膜標本，每例標本1/2行免疫熒光組織化學染色，1/2行Western blot方法進行檢測，分別觀察上述組織中EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白的表達。1免疫熒光組織化學染

12、色：將新鮮結(jié)膜組織及翼狀胬肉組織分別用冰凍組織包埋劑OCT（美國Miles公司）包埋，冰凍組織超微切片，置-80冰箱備用。超微組織切片用10%甲醛液固定10 min，玻片置于PBS加2%小牛血清液中20 min，以去除非特異性染色，然后加第1抗體于玻片置室溫1 h，PBS漂洗3次，每次5 min。再加熒光標記的第2抗體于玻片上，置室溫1 h，同上漂洗，常規(guī)封片。于日本Topcon熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，用Nikon相機及Kodak膠卷攝影。2Western blot標本處理：用分離法分別提取正常結(jié)膜及翼狀胬肉上皮，置于含有酶抑制劑的細胞溶解緩沖液(150 mmol/L NaCl、1NP-40、0

13、.5去氧膽酸及50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)中，室溫下1 h，離心10 min(13 000 r/min)，取上清液，檢測蛋白濃度。3Western blot檢測：將同一蛋白濃度的待測標本、陽性對照及陰性對照樣本煮沸3 min，分別加入4%15% 十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠，電泳4560 min(電壓200 V)。將帶有蛋白帶的凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，在90 V電壓下轉(zhuǎn)移1 h，將其置于3%無脂牛奶中1 h(去除非特異性染色)后取出，加第1抗體(抗體稀釋液：1%小牛血清、Tris鹽溶液、0.5 Tween 20)于硝酸纖維膜，室溫下1 h，漂洗3次后加HRP標記的抗1

14、抗體，再置室溫1 h，漂洗3次，用放射自顯影法顯影，Kodak X膠片攝影。Western blot方法顯示的蛋白帶密度直觀進行比較。結(jié)果一、免疫熒光組織化學染色EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白呈細胞膜型染色，細胞核及細胞漿染色陰性。在正常結(jié)膜上皮標本中，EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白均呈陽性染色，但染色部位不同；EGFR蛋白表達于正常結(jié)膜上皮的基底層細胞，表層細胞染色極弱或陰性；ErbB2及ErbB3蛋白則表達于結(jié)膜上皮的表層細胞，基底層細胞染色極弱或陰性。15例翼狀胬肉標本中，4例EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白染色方式與正常結(jié)膜相似；11例與正常結(jié)膜明顯不同，與正常結(jié)膜相比

15、，EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白均表達于翼狀胬肉上皮的全層(16)，且染色較正常結(jié)膜上皮強。二、Western blot檢測結(jié)果 取相同蛋白濃度檢測發(fā)現(xiàn)，在15例標本中，免疫熒光染色上皮呈全層染色的11例翼狀胬肉其上皮EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白表達帶較正常結(jié)膜密度明顯增高(7)。 4例免疫熒光組織化學表達方式與正常相似，其EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白帶的密度與正?；鞠嗨?。由此可見，正常結(jié)膜及翼狀胬肉上皮組織均存在EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白，進一步證實了免疫熒光組織化學染色的結(jié)果。討論目前翼狀胬肉已成為眼表面最為重要的疾病之一。由于其患病率高及術(shù)后復發(fā)率高等特

16、點，翼狀胬肉的研究一直受到許多學者的關(guān)注。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，紫外線輻射是使其發(fā)病較為重要的因素1,2,4-6，但其發(fā)病機制至今尚未闡明。以往認為翼狀胬肉是結(jié)膜組織變性性疾病，但在臨床的觀察中并不完全支持這一結(jié)論，筆者通過觀察表皮生長因子受體家族在翼狀胬肉上皮的表達，旨在為提供其發(fā)病機制的依據(jù)。一、表皮生長因子受體的功能及表達表皮生長因子受體家族包括EGFR、ErbB2、ErbB3及ErbB4 4個成員，它們具有共同的分子結(jié)構(gòu)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，EGFR、ErbB2及ErbB3與細胞的增殖、移行及分化有密切的關(guān)系，并在其調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著十分重要的作用10,11。在腫瘤的研究中，EGFR、ErbB2

17、及ErbB3呈現(xiàn)高表達，且其表達量與某些腫瘤的預后有明確的關(guān)系，被認為可能與某些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)9,12。表皮生長因子受體家族是一類與細胞分裂、移行及增殖明顯相關(guān)的受體，當該受體家族在某些細胞表達增加時，說明這些細胞處于增殖的活躍期。在細胞培養(yǎng)及動物實驗中發(fā)現(xiàn)，EGFR在角膜傷口愈合中表達明顯增加13，說明表皮因子受體家族與眼表面上皮細胞的生長有關(guān)。筆者在檢測角膜、角膜緣及結(jié)膜上皮中表皮生長因子受體家族的表達中發(fā)現(xiàn)，EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白在正常角膜、角膜緣及結(jié)膜上皮中，均有表達；在眼表面上皮的表達中，EGFR主要表達于具有分裂能力的細胞，而ErbB2及ErbB3則主要表達于終

18、末細胞。二、翼狀胬肉可能是一種組織增生性疾病本文的研究結(jié)果顯示，在15例初發(fā)期翼狀胬肉上皮中，11例翼狀胬肉上皮中的EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白陽性表達帶較正常結(jié)膜的密度高，提示翼狀胬肉上皮細胞呈現(xiàn)高增殖狀態(tài)。細胞的高增殖狀態(tài)是組織增生性疾病的生物學標志。最近的研究發(fā)現(xiàn)，p53基因在翼狀胬肉表達增加5,6，在我們的研究中也發(fā)現(xiàn)了突變型p53基因的表達與此疾病的家族史及紫外線輻射有明確的關(guān)系。此外臨床上翼狀胬肉表現(xiàn)為新生組織不停的增生，并向角膜浸潤，符合組織增生性疾病的臨床表現(xiàn)。因此，我們認為翼狀胬肉是組織增生性疾病而不是組織變性性疾病，細胞因子及其受體的異常表達可能與該病的發(fā)生及發(fā)展有

19、關(guān)。三、翼狀胬肉的發(fā)病機制探討目前對翼狀胬肉上皮表皮生長因子受體家族表達增加的研究結(jié)果，尚不能明確顯示其是否為翼狀胬肉發(fā)病的原因還是結(jié)果，這尚需進一步的研究。但是，翼狀胬肉上皮細胞因子及其受體與其基質(zhì)的細胞因子的相互作用是影響翼狀胬肉發(fā)生、進展及復發(fā)的重要因素之一14-16。1 正常結(jié)膜上皮EGFR主要表達基底層細胞 免疫熒光染色×2002 正常結(jié)膜上皮ErbB2蛋白主要表達于表層細胞 免疫熒光染色×2003 正常結(jié)膜上皮ErbB3蛋白主要表達于表層細胞表 免疫熒光染色×2004 翼狀胬肉上能上能下EGFR蛋白全層細胞均表達 免疫熒光染色×2005 翼狀

20、胬肉上能上能下ErbB2蛋白全層細胞均表達 免疫熒光染色×2006 翼狀胬肉上皮ErbB3蛋白全層細胞均表達 免疫熒光染色×2001示陽性對照，2示正常結(jié)膜，3示翼狀胬肉7Western blot 檢測電泳（本文編輯：蔡麗楓）作者單位：劉祖國（510060 廣州，中山醫(yī)科大學中山眼科中心）張梅（510060 廣州，中山醫(yī)科大學中山眼科中心）謝玉環(huán)（Ocular Surface Center, Bascom Palmer Eye Institute, University of Miami School of Medicine, Miami, FL, USA）Stephen

21、C. Pflugfelder（Ocular Surface Center, Bascom Palmer Eye Institute, University of Miami School of Medicine, Miami, FL, USA）參考文獻1，Taylor HR, West S, Munoz B, et al. The long-term effects of visible light on the eye. Arch Ophthalmol, 1992,110:99-104.2，薛季成.從地理分布看翼狀胬肉與紫外線之關(guān)系.眼外傷職業(yè)眼病雜志, 1986，3:153-156.3，H

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