結腸癌根治術后腹腔熱化療對T淋巴細胞亞群及細胞因子的影響

1、結腸癌根治術后腹腔熱化療對T淋巴細胞亞群及細胞因子的影響         08-07-26 15:23:00     編輯：studa20             作者：胡敏超 方萬強 余健雄 吳瑞景 付春利【摘要】  目的：探討腹腔熱化學治療對機體細胞免疫水平的影響。方法：將135例結腸癌根治性切除術后分為A,B兩組治療。A組65例，采用卡鉑、5

2、Fu以及絲裂霉素分次溶入加熱至4550的生理鹽水中腹腔注射；B組65例將上述化療藥物溶入常溫生理鹽水中腹腔注射，C組62例為健康正常對照組且未行腹腔灌注化療。分別觀察3組病例外周血T淋巴細胞亞群和細胞因子（IL4與IFN）的變化。結果：A組熱化療后15 d時，CD4+水平較術后第7天明顯增加(t=2.32，P0.05)，CD8+水平明顯低于B組同期水平(t=3.00，P0.05)，IL4水平較術后第7天明顯下降(t=2.65，P0.05)，而IFNr水平明顯增加（t=2.70，P0.05）。CD4百分比與IFNr水平正相關，CD8百分比與IL4水平正相關。結論：結腸癌根治性切除術后熱化療，在殺

3、滅腫瘤細胞的同時，可誘導機體產(chǎn)生抗腫瘤的細胞免疫應答。 【關鍵詞】  結腸腫瘤 熱療；化學治療；細胞免疫    Abstract  Objective: To investigate the effect of intraperitoneal thermochemotherapy on Tlymphocyte subsets and cytokine after radical resection of colon cancer. Methods: A total of 135 cases of colon cancer were divide

4、d into group A and B. Group A(65 cases) were treated with carboplatin, 5Fu and mitomycin which were dissolved respectively with 4550 normal saline and injected into abdomen cavity after radical resection, and Group  B were treated with above mentioned drugs which were soluted with normal saline

5、 of normal temperature and injected into the abdominal cavity after radical resection. And there were 62 cases of healthy individuals as control (group C). The level of Tlymphocyte subsets and cytokine were explored in these groups. Results: In group A at 15 day after thermochemotherapy, the level o

6、f CD4+  Tlymphocyte subsets increased significantly(t=2.32,P0.05), CD4+  Tlymphocyte subsets decreased significantly (t=3.00,P0.05), the level of IL4 decreased(t=2.65,P0.05) but IFNr increased significantly(t=2.70, P0.05). The percentage of CD4+T lymphocyte subsets was positively coherent

7、with the level of IFNr, and so was the percentage of CD8+T lymphocyte subsets with the level of IL4. Conclusion: Intraperitoneal thermochemotherapy after radical resection of colon cancer can not only eradicate disseminated tumor cells in abdomen but also induce tumorspecific cellular immunity. 

8、;   Key words   Colon neoplasm； Thermotherapy； Chemotherapy； Cellular immunity    結腸癌浸潤漿膜層后往往發(fā)生肉眼或鏡下的腹膜播散種植，而結腸癌的門靜脈轉移甚至可發(fā)生Dukes A期，結腸癌腹膜播散種植和肝轉移是術后復發(fā)和轉移的重要原因，即使采用D4廓清手術都不能清除潛在的癌細胞腹膜和門靜脈播散15。惡性腫瘤對高溫的耐受性差，熱療可促使腫瘤細胞壞死、促使腫瘤細胞相關抗原的暴露以及提升腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，這是腹腔熱化療的理論依據(jù)之一6, 7

9、。近年來許多研究證明，腹腔熱灌注化療能明顯減少結腸癌腹腔內種植和肝轉移8, 9，但是腹腔熱化療對機體免疫功能的影響國內外報道較少，我院20012006年共對65例結腸癌根治性切除術后行熱化療，觀察熱化療對機體細胞免疫水平的影響，現(xiàn)報告如下。    1  臨床資料    1.1  一般資料：本組135例，男86例，女49例，年齡2182歲，平均（51.2±7.3）歲,中位年齡52.0歲。133例為單發(fā)癌灶，2例為2個癌灶（乙狀結腸和升結腸以及結腸脾曲和橫結腸）。單發(fā)瘤灶部位：乙狀結腸癌34例，升結腸癌26例

10、，結腸脾曲癌12例，橫結腸癌22例，結腸肝曲6例，降結腸癌11例，盲腸癌22例。Dukes分期：A期6例，B期53例，C期72例，D期4例。病理類型：管狀腺癌21例，乳頭狀腺癌37例，黏液腺癌32例，印戒細胞癌24例，未分化癌15例，鱗癌4例，腺棘皮癌2例。本組病例術前均作電子結腸鏡檢查，鏡下活檢病理提示為結腸癌。    1.2  分組：本組135例采用雙盲隨機抽信封的方法分為兩組。熱化療組（A組）65例。常規(guī)化療組（B組）70例。兩組在性別、年齡組成、腫瘤分期以及病理類型各方面無統(tǒng)計學差異，資料具有可比性。另取良性結直腸疾病（結腸良性息肉、重度痔以及結

11、腸冗長綜合征等）而住院的62例患者作為正常對照組（C組），入院前3月內以及住院期間，無放療化療過程，無嚴重感染過程。    1.3  治療方法    A組患者于根治術后1周應用中心靜脈穿刺設備經(jīng)麥氏點處腹壁將導管置入腹腔，穿刺成功后滴注500 mL生理鹽水2 h無特殊不適后，將化療藥物溶入生理鹽水500 mL中，加熱至4550，直接進行腹腔熱灌注，1次/d×5 d為1個療程。第1天灌注卡鉑（200 mg/m2），第2天灌注5Fu（400 mg/m2），第3天灌注絲裂霉素(MMC，5 mg/m2），第4天灌注5Fu

12、1（400 mg/m2），第5天灌注MMC(5 mg/m2）8,10。B組患者于根治術后1周將化療藥物溶入生理鹽水500 mL中，腹腔穿刺以及化療藥物的方案同A組。C組根據(jù)原發(fā)疾病進行相應的?？浦委?。    1.4  監(jiān)測方法    FITC和PE標記的鼠抗人CD4+和CD8+單克隆抗體購自EB公司，采用流式細胞儀監(jiān)測患者外周血T淋巴細胞亞群的變化，IL4和IFN的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA)，檢測試劑盒購自EB公司，監(jiān)測患者治療前后血清細胞因子水平的變化。    A組和B組于手術后第7天、化療完

13、成后第7天和第15天后空腹抽血，C組患者于入院后第1天空腹抽血，標本留取方法同A組和B組。    無菌取空腹靜脈血5 mL，肝素抗凝處理，1000 r/min離心5 min，取下層細胞團，細胞團內培養(yǎng)液少于25 l，送流式細胞學檢查T淋巴細胞亞群。步驟：加入FITC和PE標記的CD4+、CD8+表面分子的單克隆抗體15 l，混合均勻，4下避光反應30 min。PBS洗滌2次后，棄上清，加入1 mL的1%甲醛，固定30 min。加樣槍將熒光標記抗體結合的細胞加入BeckmanCoulter流式細胞儀的檢測孔內，檢測淋巴細胞CD4+和CD8+表面分子的表達以了解外周血

14、內T淋巴細胞亞群的變化情況11。數(shù)據(jù)以表達率的95%可信區(qū)間作為衡量表達情況的標準。    其余上清再次4000 r/min離心5min，吸取上清，-20凍存，標本滿24個時ELISA方法監(jiān)測IL4和IFN。步驟：用俘獲抗體包被96孔板，4孵化過夜。吸干孔內液體，每孔加300 L洗滌液，共洗滌3次。每孔加200 L的Assay Diluent封閉，室溫下孵化1 h。吸干封閉液后洗滌板孔。除空白孔外，分別將不同濃度（2倍連續(xù)稀釋）標準品、待測血清加入相應的反應孔中（100 L/孔），每個標本設3個復孔。用封板膠紙封住反應孔，置37孵箱孵育2 h。重復吸干、洗滌板孔5

15、次。除空白孔外，每孔加入抗體工作液100 L，用封板膠紙封住反應孔，置室溫孵育1 h。重復吸干、洗滌板孔5次。除空白孔外，每孔加入酶結合物工作液100 L，用封板膠紙封住反應孔，置室溫下孵箱孵育30 min。重復吸干、洗滌板孔7次。每孔加底物溶液100 L，室溫下孵箱孵育15 min。每孔加終止液50 L。反應完畢后，即刻在酶標儀上讀取樣本孔及標準品孔的OD450nm值和OD570nm值，以二者差值和對應的細胞因子濃度的常用對數(shù)值，分別作縱、橫坐標，繪制標準曲線，從標準曲線求出樣本的細胞因子濃度12。    1.5  統(tǒng)計學處理：3組患者的計量資料的描述

16、采用均數(shù)±標準差（±s），采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學比較，組間均數(shù)比較應用獨立t檢驗進行比較，非正態(tài)分布計數(shù)資料組間比較用MannWhitney U檢驗，淋巴細胞亞群和細胞因子之間的關系采用Spearman相關分析，設定為0.05。所有數(shù)據(jù)均在計算機SPSS13.0統(tǒng)計軟件上進行運算。    2  結  果    2.1  T淋巴細胞亞群變化：見表1。    經(jīng)單因素方差分析，3組患者的CD4以及CD8變化存在統(tǒng)計學差異經(jīng)獨立樣本的t檢驗，A組和B組術后

17、第7天以及化療后第7天的CD4低于C組（t=1.86，P<0.05；t=2.02，P<0.05）；而A組和B組之間于術后第7天以及化療后第7天無明顯差別（t=1.50，P0.05；t=1.42，P0.05），和B組化療后15 d相比較，A組熱化療后15 d的CD4+明顯增加(t=2.60，P<0.05)；經(jīng)配對t檢驗，A組熱化療后15 d的CD4+水平較術后第7天以及化療后第7天明顯增加(t=2.32，P<0.05)。    經(jīng)配對t檢驗，A組患者熱化療后15天的CD8+水平較術后第7天以及化療后第7天明顯下降（t=2.46，P<0.

18、05；t=1.99，P<0.05；）；B組患者化療后15 d的CD8+水平較術后第7天以及化療后第7天有所增加，但未達到統(tǒng)計學差異（t=1.12，P0.05；t=1.33，P0.05），經(jīng)獨立樣本的t檢驗，A組患者化療后15 d的CD8+水平和C組無明顯差別（t=1.28，P0.05），B組患者化療后15 d的CD8+水平明顯高于A組同期水平(t=3.00，P<0.05)。表1  3組患者淋巴細胞亞群變化    2.3  外周血IL4和IFNr水平變化：見表2。    經(jīng)單因素方差分析，3組患者外周血IL4和IFNr水平變化