參龍煎劑對肺纖維化肺組織形態(tài)學(xué)影響的實驗研究

1、參龍煎劑對肺纖維化肺組織形態(tài)學(xué)影響的實驗研究    【摘要】  目的：觀察參龍煎劑對博來霉素致大鼠肺纖維化的防治作用。方法：將大鼠按照性別、體重隨機分為空白組、模型組、潑尼松組（5.4mg/kg）、參龍煎劑低劑量組（生藥量0.675g/ml）、參龍煎劑中劑量組（生藥量1.2g/ml）、參龍煎劑高劑量組（生藥量2.4g/ml）。按照BLM5mg?kg1體重復(fù)制大鼠肺纖維化模型。24小時后給藥，觀察各實驗組7天、14天、28天肺組織病理形態(tài)表達情況的變化。結(jié)果：參龍煎劑治療后模型大鼠肺部炎癥浸潤情況減輕、肺泡破損減輕、膠原沉積減少。結(jié)論：結(jié)果表明，

2、證實了參龍煎劑能夠改善肺纖維化的異常組織結(jié)構(gòu)，使延緩肺纖維化的病程成為了可能。 【關(guān)鍵詞】  肺纖維化 HE染色 Masson染色肺纖維化是一組病因各異、表現(xiàn)相似的疾病譜，其病理主要表現(xiàn)為早期的炎癥細胞浸潤、肺組織損傷，晚期的細胞外基質(zhì)及膠原沉積和肺組織結(jié)構(gòu)的重塑1。許多研究表明，肺纖維化初期肺組織病理學(xué)改變以肺炎癥浸潤為主，大量的炎癥細胞浸潤，肺組織充血、腫脹，后期則以膠原纖維增生為主，大量膠原纖維代替正常組織，使肺組織破壞、功能喪失23。本實驗旨在觀察參龍煎劑即通過補肺益腎、祛瘀通絡(luò)法對肺纖維化作用機制進行探討。通過對各組大鼠的一般狀態(tài)、病理形態(tài)的比較來說明參龍煎劑對博萊霉素引起

3、的機體系統(tǒng)臟器損傷和一般功能狀態(tài)的損害有一定的保護作用。1  資料1.1  實驗動物 健康Wistar大鼠216只：雌雄各半，體重180210g，由沈陽醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供（動物許可證號：SCXK（遼）2003-0016），按清潔級標(biāo)準飼養(yǎng)。1.2  實驗藥品 鹽酸平陽霉素（BLM）：哈爾濱博萊制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字：H23021807，批號06060201，8mg/支。參龍煎劑：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院制劑室制備，主要成分由黃芪、沙參、當(dāng)歸、川芎、熟地、地龍、甘草等中藥組成。醋酸潑尼松片：國藥準字H12020698，產(chǎn)品批號051108。

4、5mg/片，天津天藥藥業(yè)股份有限公司。1.3  主要試劑及儀器萬能顯微鏡（日本  OLYMPUS 公司）BI-2000圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；HE染色、Masson染色試劑（中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司）。2  實驗方法2.1  動物模型制備 參照Szapiel4方法，將大鼠麻醉，暴露氣管，一次性注入BLM注射液（5mg?kg1），左右旋轉(zhuǎn)鼠板，使BLM注射液均勻分布于兩肺，制成模型。2.2  實驗動物分組及給藥方法 實驗動物按雌雄、體重分層隨機分為6組，每組36只，每天灌胃一次，每周復(fù)查體重，調(diào)整給藥量。共飼養(yǎng)4

5、周，分別于7天、14天、28天3個時間點取材，每次處死12只動物。分組：正常對照組、模型組、潑尼松組（5.4mg/kg）、參龍煎劑低劑量組（生藥量0.675g/ml）、參龍煎劑中劑量組（生藥量1.2g/ml）、參龍煎劑高劑量組（生藥量2.4g/ml）。正常組、模型組建模后第2日起每日予以1ml/kg生理鹽水灌胃。其余各組按配好的藥品以等容藥品灌胃。2.3  標(biāo)本的制備  腹主動脈放血至死，剖開胸腔和頸部，分離氣管和肺臟，取下肺葉，用冰鹽水洗去血渣，剔除結(jié)締組織，濾紙吸干。稱重后，同時結(jié)扎右主支氣管，從肺門部離斷，右肺上葉用定量輸液泵小心灌入含有1/1000DFFC4%多聚甲

6、醛溶液在25cmH20壓力下進行灌注固定，切成1.5×1.5×1cm3大小，30分鐘后投入多聚甲醛溶液固定一周。取固定好的組織，在橫頸最大處3mm后組織片，常規(guī)脫水，二甲苯透明，用自動石蠟包理機。切面4um的切片。備做HE、MASSON染色、光學(xué)顯微鏡下觀察。2.4  病理形態(tài)學(xué)定量分析 用BI-2000圖像分析系統(tǒng)對HE染色病理切片進行光密度（OD值）測定。掃描時將切片分為3個區(qū)域：肺泡腔內(nèi)無組織結(jié)構(gòu)，OD值最低，定為無染區(qū)，其面積代表肺泡腔的面積；細胞核的OD值最高，定為深染區(qū)，其面積反映炎癥細胞浸潤程度；細胞外基質(zhì)和炎癥滲出染色較細胞核淺，HE切片

7、中為粉色或淺粉，定為淺染區(qū)，與肺泡炎階段炎性水腫和滲出的區(qū)域基本一致，在模型晚期其面積主要反映細胞外基質(zhì)沉積程度。將切片置于圖像掃描分析儀顯微鏡下，在放大200倍條件下，每張切片分別從四周和中間隨機選5個視野，測定深染區(qū)、淺染區(qū)和無染區(qū)所占的面積。2.5  利用HE染色的病理切片，確定肺泡炎等級判定方法病變程度確定根據(jù)Szapiel等4的方法確定肺泡炎和肺纖維化的程度。利用HE染色的病理切片將肺泡炎分為四級：（）無肺泡炎；（+）輕度肺泡炎，單核細胞浸潤面積20%，結(jié)構(gòu)正常。（+）中度肺泡炎受累面積20%50%。（+）重度肺泡炎，受累面積50%。 2.6  利用Masson氏

8、三色染色的病理切片，確定肺纖維化等級判定方法根據(jù)Szapiel等4的方法，分為四級：0級：無肺間質(zhì)纖維化（）；1級：輕度肺間質(zhì)纖維化（+），病變范圍局限在全肺20%以下；2級：中度肺間質(zhì)纖維化（+），病變范圍占全肺20%50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。2.7  統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件單因素方差分析（one Way Anova），統(tǒng)計結(jié)果用（x±s）表示。3  實驗結(jié)果3.1  肉眼觀察肺組織外觀形態(tài)正常組大鼠雙肺呈淡紅色，表面光滑，灌洗時彈性好，未見出血點。7天時，造纖維化模型各組均有明顯增大，質(zhì)地堅硬，顏色鮮紅，并見肺組織輕度

9、充血，表面出血點增加，以模型組最為嚴重。14天、28天后，模型組表現(xiàn)雙肺體積略縮小，質(zhì)地硬，顏色暗紅，表面粗糙不平，可見小片狀、凸凹不平蒼白灶，灌洗時彈性減弱，表面出血點散在，并見瘀斑。參龍煎劑各組肺組織顏色粉紅色，表面略粗糙，灌洗時彈性尚好，體積無明顯縮小，偶見出血點。激素組肺組織呈粉紅色，表面光滑，灌洗時彈性好。3.2  肺組織病理形態(tài)觀察HE染色可見各造模組均有程度不等的肺泡炎，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)有不等的炎性細胞浸潤，以巨噬細胞、淋巴細胞及少量的中性粒細胞為主，模型組最明顯，而參龍煎劑中劑量組治療效果最好。（見圖2）MASSON染色中造模各組肺間質(zhì)、支氣管壁和肺泡隔膠原染色中膠原

10、纖維明顯增多，以模型組最多。7天時膠原纖維主要分布于細小支氣管及小血管周圍，肺泡間質(zhì)散在的膠原纖維，膠原纖維較短，尚未形成片狀及束狀；14天時，小氣管、小血管膠原纖維明顯增多，支氣管偶見少量束狀膠原纖維，肺間質(zhì)膠原纖維呈束狀或小片狀分布；28天時，支氣管、小支氣管、小血管大量膠原纖維環(huán)繞，周圍膠原增生并向肺間質(zhì)延伸在間質(zhì)沉積，呈片狀、束狀，但治療組病變程度均要比模型組輕。3.3  各組大鼠不同時間點HE切片深染區(qū)比較情況結(jié)果顯示：HE染色病理切片深染區(qū)面積代表炎性浸潤：正常組大鼠各個時間點的深染區(qū)面積明顯小于其它各組。P0.05或P0.01；模型組炎性浸潤隨時間的推移，逐漸減低，各個

11、時間點都大于中劑量和激素組有明顯的差異，P0.05或P0.01；參龍煎劑各個劑量組深染區(qū)的面積也有逐漸減少的趨勢，且以中劑量增加減少幅度最大，14天、28天與高劑量、低劑量有統(tǒng)計學(xué)意義P0.05，且與激素組效果相似；各個時間點參龍煎劑各個劑量均呈量效關(guān)系趨勢（見表1、圖1）表1  各組大鼠不同時間點HE切片深染區(qū)比較（略）注：?P0.05 compared with N；?P0.01 compared with N；?|P0.05 compared with M；?|?|P0.01compared with M；?P0.05 compared with MD。3.4  肺泡

12、炎、肺纖維化分級比較（見表2）。表2 各個時間點肺泡炎及肺纖維化分級比較（略）4  討論肺部的病理組織形態(tài)改變是最直觀的療效衡量標(biāo)準。實驗結(jié)果表明，模型組大鼠肺臟從外觀可見明顯的充血、水腫、瘀點瘀斑、肺組織明顯增大、質(zhì)硬，而參龍煎劑各組肺組織形態(tài)明顯好于模型組。肺組織輕度充血、水腫，肺組織增大、質(zhì)略硬。與激素組比較，色澤較深、較粗糙、較大。從光鏡檢測結(jié)果可見，模型組肺組織可見明顯的炎癥及纖維化的改變，早期大量炎性細胞浸潤，肺組織大量充血、水腫；晚期，纖維化沉積。參龍煎劑組肺部病變程度顯著減輕、病變范圍局限。無論是外觀還是光鏡下的檢測情況，均可見肺泡炎和纖維化，這證明了參龍煎劑對肺纖維

13、化有積極的干預(yù)作用，從而表明了其可靠的治療效果。病理形態(tài)半定量分析，把切片從整體上進行平均炎癥浸潤程度、纖維化程度及正常肺組織面積來判定。經(jīng)參龍煎劑治療的大鼠的肺泡腔面積顯著增加（即無染區(qū)增加）而代表肺泡炎的深染區(qū)面積和代表纖維沉積的淺染區(qū)面積明顯減少，在各個時間點與模型組差異顯著。肺組織的等級資料分析，是對肺泡炎及纖維化個數(shù)判定的指標(biāo)。通過分析，模型組多呈中、重度肺泡炎或纖維化改變，而參龍煎劑各個劑量組合激素組則多呈輕、中度肺泡炎或肺纖維化改變，與激素組比較無明顯差異。通過這兩種方法的分析，可能說明了參龍煎劑起到了抑制肺泡炎的加重，抑制了膠原纖維的沉積，減緩了肺纖維化的進程，減輕了肺纖維化的

14、病變程度。5  小結(jié)目前，我們所采用的方法復(fù)制出的只是一種藥物性肺纖維化，不論從發(fā)病機制還是療效評價，都有一定的局限性，且樣本較小，治療時間短，還不能全面、充分的反映出臨床上的錯綜復(fù)雜的情況。在今后，自發(fā)性動物疾病近似于人類疾病，所以要大力開展自發(fā)性動物模型的探尋工作。現(xiàn)在，中醫(yī)藥的治療尚在初步階段，并且有很好的前景，相信在今后我們能充分利用中醫(yī)的優(yōu)勢來對自發(fā)性動物模型進行研究實驗?！緟⒖嘉墨I】  1 Crystal RG,Bitterman PB,Rennerds letal .interstitial lung diseases of causes:disorders characterized by chronic inflammation of theolwer respiratory tract.N EI Jmed :1984,310:154166.2 趙洪文，彭 璐肺纖維化大鼠BALF中細胞成分和肺組織病理的動態(tài)研究J中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1997，26（5）：4634663 柴文戌，李永春，劉玉玲，等博萊霉素大鼠致肺纖維化形態(tài)學(xué)變化的實驗研究J中國實驗動物學(xué)報，2003，11（2）：77804 Szapiel SV,Elson