南蛇藤莖提取物調(diào)控Notch1抑制肝癌血管擬態(tài)的作用及機(jī)制

1、南蛇藤莖提取物調(diào)控 Notch1 抑制肝癌血管擬態(tài)的作用及機(jī)制引言原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌 (hepatocellular carcinoma,HCC) 是一種高度異質(zhì) 性、癌性血管豐富的惡性實(shí)體腫瘤 , 早期診斷率低。根治性切除或肝臟移植后大 部分病例在 2 年內(nèi)形成肝內(nèi)復(fù)發(fā)或肝外轉(zhuǎn)移 ,5 年生存率較低。中晚期患者由于受基礎(chǔ)肝功能的影響 , 目前尚缺乏反應(yīng)率高且相對安全的治 療措施。因此肝癌的綜合治療策略亟待進(jìn)一步研究及補(bǔ)充。傳統(tǒng)的抗內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管 (endothelial dependent vessel,EDV) 生成在 實(shí)體腫瘤治療中的不理想 , 提示了可能存在另外一種相對獨(dú)立的微血管系

2、統(tǒng)參與 腫瘤血供。擬態(tài)血管 (vasculogenic mimicry,VM) 是由腫瘤細(xì)胞獨(dú)立形成的、參 與腫瘤血供及轉(zhuǎn)移的微血管結(jié)構(gòu) , 它的形成是腫瘤細(xì)胞自身塑性改變以及腫瘤細(xì) 胞與局部微環(huán)境相互作用的結(jié)果 , 多種腫瘤基因及血管生成調(diào)節(jié)基因參與其中。惡性腫瘤中VM的形成多與不良預(yù)后密切相關(guān)。Notch基因目前發(fā)現(xiàn)4種 (Notch1-4) 亞結(jié)構(gòu),是哺乳動物胚胎發(fā)育過程中重要的調(diào)控基因。在胚胎后的腫瘤形成及進(jìn)展、 組織纖維化、血管生成中發(fā)揮重要作用。 Notch 基因在黑色素瘤及乳腺癌的血管擬態(tài)中均發(fā)揮重要作用。而關(guān)于 Notch1 在肝癌血管擬態(tài)形成中的作用及機(jī)制 ,目前鮮有報(bào)道。

3、肝癌中 醫(yī)稱為肝積 , 屬于現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合理論中的絡(luò)病范疇。肝癌的血管生成是一種病絡(luò)的綜合表現(xiàn) , 其病機(jī)要素為“虛、瘀、毒”。病絡(luò) 是肝癌生長和轉(zhuǎn)移的主要途徑。理論上講肝癌的血管擬態(tài)亦是一種病絡(luò)。根據(jù)“辛以通絡(luò)”原則 , 辛藥具有 活血祛瘀、解毒散結(jié)功效的可發(fā)揮抑制病絡(luò)的作用。目前一些基礎(chǔ)研究顯示具備上述性味的中藥能夠抑制血管擬態(tài)的形成。 南蛇 藤(Celastrus Orbiculatus Thunb)系衛(wèi)茅科藤屬藥用植物,全草入藥,苦溫微辛, 入肝與膀胱經(jīng) , 功能行氣活血、祛毒消腫。課題組前期的研究證實(shí)南蛇藤莖乙酸乙酯提取物 (Celastrus OrbiculatusExtracti

4、on,COE) 能夠抑制肝癌的內(nèi)皮依賴性血管生成 ; 抑制胃癌細(xì)胞的上皮間 質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT) 減少胃癌裸鼠模型的轉(zhuǎn)移。 但是，關(guān)于COE能否調(diào)控Notch1抑制肝癌的血管擬態(tài)，目前未檢索到相關(guān)的文獻(xiàn) 報(bào)道。為此,本研究圍繞這一核心問題 ,從以下四個部分展開相應(yīng)的研究 ,力圖證 實(shí):1)Notch1在肝癌血管擬態(tài)中的作用及可能的機(jī)制;2)COE能否通過調(diào)控 Notch1 抑制血管擬態(tài) , 進(jìn)而抑制肝癌的生長。通過本課題的開展 , 以期為肝癌的 中醫(yī)藥治療提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本課題共分為四個研究部分。第一部分 Notch1

5、在肝癌組織中的表達(dá)及其與 血管擬態(tài)的關(guān)系目的：檢測Notch1及其下游靶蛋白Hes1、EMT相關(guān)蛋白E cadherin及vimentin在肝癌組織中的表達(dá)水平,分析Notch1、EMT與肝癌VM的 相關(guān)性；揭VM在肝癌進(jìn)展預(yù)后中的臨床意義。方法 : 收集肝癌手術(shù)標(biāo)本 , 并根據(jù)標(biāo)本來源信息對患者進(jìn)行追蹤隨訪。 免疫組 織化學(xué)染色 (immunohistochemical staining,IHC) 檢測 Notch1 、Hes1 及 EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá),以RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。PAS-CD3雙染色檢測VM分析各蛋白表達(dá)水平與VM的相關(guān)性。應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制肝癌患者術(shù)后生存

6、曲線,比較有無VM對術(shù)后復(fù)發(fā)的影響。 結(jié)果：在收集的44例肝癌標(biāo)本中，Notch1及Hes1在肝癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織明顯上調(diào) (P<；0.001) 。共 17 例(38.64%,17/44) 檢出 VM 結(jié) 構(gòu),Notch1、Hes1的表達(dá)水平與VM檢出率呈正性相關(guān)(r=0.590,0.568,P<0.001、 0.001) 。12例(27.27%,12/44)檢出肝癌細(xì)胞中vimentin表達(dá)，陽性率與VM正性相關(guān)(r=0.963,P<0.001)。 Notch1表達(dá)水平在 Vimentin陽性標(biāo)本中顯著提高(P<0.001)。Kaplan-Meier生存分析顯

7、示Notch1、Hes1表達(dá)升高及VM陽性提示肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)。結(jié)論:VM的出現(xiàn)會提示肝癌術(shù)后的早期復(fù)發(fā),Notch1表達(dá)上調(diào)與肝 癌EMT?；癡M的形成存在相關(guān)性。第二部分 Notch1 對肝癌細(xì)胞體外血管擬態(tài)的影響目的 : 研究 Notch1 在肝癌細(xì)胞體外血管擬態(tài)中發(fā)揮的作用 , 探討其促進(jìn)肝癌細(xì)胞血管擬態(tài)的機(jī)制。方法 : 通過體外三維培養(yǎng)比較低侵襲人肝癌細(xì)胞HepG2和高侵襲人肝癌細(xì)胞MHCC97-H的小管形成能力,以RT-PCR及 Western Blot比較兩種細(xì)胞的Notch1轉(zhuǎn)錄及表達(dá) 水平, 確定實(shí)驗(yàn)靶細(xì)胞。繼而以慢病毒載體表達(dá)技術(shù)實(shí)現(xiàn) HepG2細(xì)胞中Notch1過表達(dá),

8、MHCC97-H細(xì)胞中Notch1消減表達(dá),獲得HepG2/Notch1+及MHCC97-H/Notch1-轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通 過三維培養(yǎng)比較轉(zhuǎn)化細(xì)胞的血管擬態(tài)能力 ; 以熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞 F-actin 骨架蛋白，以 RT-PCR及 Weatern Blot 檢測 vimentin 及 E-cadherin 的 轉(zhuǎn)錄及表達(dá) , 觀察調(diào)控 Notch1 后肝癌細(xì)胞自身塑形的變化。最后，以TGF-B 1誘導(dǎo),觀察Notch1表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞VM形成及EMT勺關(guān) 系。結(jié)果：低侵襲潛能的HepGZ田胞Notch1表達(dá)水平低于高侵襲潛能的 MHCC97-H 細(xì)胞,不具備體外VM形成能力。在Hep

9、G2細(xì)胞中過表達(dá)Notch1后細(xì)胞EMT潛能增加,獲得體外VM形成能 力;TGF- B 1可以誘導(dǎo)HepGZ田胞產(chǎn)生EMT在此過程中Notchl表達(dá)水平升高并出現(xiàn)血管擬態(tài)。在高表達(dá)Notchl的MHCC97-細(xì)胞中敲低Notchl,肝癌細(xì)胞EMT及 VM形成潛能受抑,對TGF-B 1誘導(dǎo)的EMT及 VM形成反應(yīng)性降低。結(jié)論:Notchl的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的 EMT進(jìn)而導(dǎo)致VM形成,下調(diào) Notchl可阻止肝癌細(xì)胞EMT抑制肝癌細(xì)胞VM發(fā)育。第三部分Notchl在人肝癌 裸鼠皮下移植瘤內(nèi)血管擬態(tài)中的作用目的：從整體水平探討Notchl與肝癌VM形 成的關(guān)系。方法：應(yīng)用本研究第二部分構(gòu)建的轉(zhuǎn)

10、化細(xì)胞 HepG2/vector、HepG2/Notch1 +、 MHCC97-H/vector、MHCC97-H/Notch1細(xì)胞分別接種至裸鼠左前腋下,形成不同人 肝癌細(xì)胞系的裸鼠皮下移植瘤模型。每隔2d測量移植瘤長短徑，繪制腫瘤生長曲 線。造模后第 28d 活體熒光觀察皮下移植瘤生長情況。處死動物 , 剝?nèi)∫浦擦龇Q 重。移植瘤組織病理學(xué)觀察；PAS-CD34雙染色及透射電鏡(transmission electron microscope,TEM) 觀察移植瘤內(nèi)VM結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)染色法檢測移 植瘤組織內(nèi)EMT標(biāo)志物vimentin及E-cadherin的表達(dá)。結(jié)果:HepG2/Not

11、ch1+移植瘤在造模后第20d生長加速,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時移植瘤 體積及瘤質(zhì)量均大于HepG2/vector;相反,MHCC97-H/Notch1-移植瘤在造模后第 20d生長開始慢于MHCC97-H/vector,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時瘤體積及質(zhì)量均小于 MHCC97-H/vector。低表達(dá) Notch1 的 HepG2/vector 和 MHCC97-H/Notch1 移植瘤 內(nèi)點(diǎn)、片狀壞死明顯,未觀察到典型的VM結(jié)構(gòu)。免疫組化染色顯示 HepG2/Notch1+及 MHCC97-H/vector移植瘤內(nèi)腫瘤細(xì)胞 vimentin著色強(qiáng)度及著色比例高于 HepG2/vector及MHCC97-H/Not

12、ch1移植瘤;相應(yīng)的E-cadherin的著色比例及強(qiáng)度在 HepG2/Notch1+及MHCC97-H/vector移植瘤內(nèi)也較低。結(jié)論:Notch1可促進(jìn)人肝癌裸鼠皮下移植瘤中的 VM形成,抑制 Notch1表達(dá)可減少VM抑制腫瘤生長。第四部分南蛇藤莖提取物調(diào)控 Notch1 抑制肝癌血管擬態(tài)目的 : 通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)動物模型實(shí)驗(yàn),證實(shí)南蛇藤莖提取物（COE）下調(diào)Notch1表達(dá),抑制 肝癌細(xì)胞EMT減少VM形成,進(jìn)而抑制腫瘤生長。方法：體外實(shí)驗(yàn)中,首先應(yīng)用 CCK-8及活細(xì)胞工作站分析COE對MHCC97-細(xì)胞增殖及匯合的抑制，在后續(xù)的實(shí) 驗(yàn)中選擇低于IC50的三組COE濃度（20

13、、40、80卩g/mL）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，陽性對照藥物 采用Notch1特異性阻斷劑DAPT（5卩M）。應(yīng)用Tran swell小室侵襲實(shí)驗(yàn)分析COE對MHCC97-細(xì)胞及TGF-B 1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的侵襲抑制；采用基質(zhì)膠小管形成實(shí)驗(yàn)觀察COE對MHCC97-細(xì)胞及TGF-B 1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞VM形成抑制。RT-PCR及 Western Blot分析COEf預(yù) 后兩種細(xì)胞Notch1、Hes1以及EMT標(biāo)記物vimentin、E-cadherin的轉(zhuǎn)錄及表達(dá) 水平； 細(xì)胞骨架蛋白 F-actin 分布及表達(dá)采用熒光結(jié)合的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記。動物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用GFP標(biāo)記的MHCC97-I細(xì)胞接種裸鼠皮

14、下形成人肝癌裸鼠皮 下移植瘤模型,造模成功后COE20 40、80mg/kg每天1次灌胃給藥,DAPT20mg/kg 每天1次腹腔注射作為陽性對照，生理鹽水為空白對照。每隔2d測量移植瘤體積， 繪制腫瘤生長曲線。第 28d 末次給藥后活體熒光觀察比較皮下移植瘤的熒光信號。 剝?nèi)×鼋M織后 稱重 , 切片病理觀察。PAS-CD3雙染色及TEM觀察各組血管擬態(tài)結(jié)構(gòu)。IHC檢測COE各濃度對移植 瘤組織中Notchl、Hes1及EMTI關(guān)蛋白vimentin、E-cadherin 表達(dá)的影響。結(jié)果:COE呈濃度及時間依賴性方式抑制 MHCC97-細(xì)胞的增殖，作用MHCC97-細(xì)胞 24h 的 IC50 為 145.88 卩 g/mL。COE各濃度（20、40、80 卩 g/mL） 及DAPT（5卩M）處理細(xì)胞24h可有效抑制MHCC97-及TGF-B 1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞 的侵襲及VM形成,COE80卩g/mL濃