TIMP-4基因的克隆、原核表達及活性測定

1、    【摘要】  目的:采用RT-PCR法獲取TIMP-4基因，并通過原核表達獲取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。方法:從SD大鼠心肌組織中提取總RNA，利用RT-PCR法擴增出TIMP-4基因，經(jīng)基因序列分析后構(gòu)建表達載體PET-28a(+)-TIMP-4，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導TIMP-4的表達。利用N2+-NTA純化和復性后，根據(jù)其骨肉瘤細胞遷移能力的影響檢測其活性。結(jié)果:克隆到編碼序列完全正確的大鼠TIMP-4基因，能在大腸桿菌中獲得高效表達，表達產(chǎn)物占全菌總蛋白的23.5%，N2+-NTA純化和復性后，純度

2、達90%以上。純化后的融合蛋白使骨肉瘤細胞株的遷移能力得到顯著抑制。結(jié)論:通過基因克隆和原核表達的方式可以大量獲得具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。 【關(guān)鍵詞】  TIMP-4基因 克隆 基因表達 免疫活性    Abstract:  Objective:To extract the gene of TIMP-4 with RT-PCR methods and obtain the bioactive rat TIMP-4 fusion protein expressed in E. Coli. Methods: Total RNA

3、 was extracted from cardiac muscle of SD rat. TIMP-4 gene was obtained and amplified with RT-PCR method. The isolated fragment was sequenced, recombined with plasmid pET-28a(+) at EcoRI and Hind sites and transformed into E.coli cells. The expression of TIMP-4 was induced by IPTG. TIMP-4 protein was

4、 purified and renaturalized by N2+-NTA. The capability of inhibiting migration of osteosarcoma cell line was used as a measure to assay its viability. Results: The TIMP-4 gene of the rat, which was cloned and correctly coded, could be highly expressed in the E.coli strain. The expressed product of t

5、he TIMP-4 amounted for 23.5% of the total bacterial protein. The TIMP-4 amounted for at least 90% after N2+-NTA purification. The purified TIMP-4 protein could significantly inhibit the migration of osteosarcoma cell line. Conclusion: TIMP-4 fusion protein with bioactivity can be obtained profusely

6、by gene cloning and expression in E. Coli.    Key words:  TIMP-4; gene clone; expression; viability assay    目前對惡性腫瘤的治療尚缺乏非常有效的措施，其主要原因在于腫瘤具有侵襲、轉(zhuǎn)移和基因變異等特性，對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制方面的研究成為腫瘤治療的關(guān)鍵。組織基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞和腫瘤新生血管的形成是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移得以實現(xiàn)的先決條件?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMP）為一類蛋白水解酶家族，它能降解多

7、種膠原蛋白、纖維連接蛋白和彈性蛋白等血管基膜和基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造合適的環(huán)境。金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP）的發(fā)現(xiàn)是腫瘤研究上的一大突破，它是MMP的天然抑制劑，目前根據(jù)發(fā)現(xiàn)的時間順序分別稱為TIMP（14）。國內(nèi)外對于TIMP-4的功能已經(jīng)有了一些研究，但結(jié)果有所差異。Jiang等1的研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-4可以抑制乳腺癌細胞的凋亡，而更多的實驗表明TIMP-4為腫瘤生長的抑制因素2，3。為進一步開展對TIMP-4在骨肉瘤和軟骨肉瘤方面的作用及其機制的研究，以及對其在其他領域的功能，本實驗采

8、用分子生物學的基因克隆、表達和純化等手段，力求獲取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白，為以后的研究打下基礎。    1  資料和方法    1.1  材料     1.1.1  組織來源：成熟SD大鼠由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。    1.1.2  菌種、質(zhì)粒和細胞：大腸桿菌TG1、BL21(DE3)、pBluescriptSK(+)質(zhì)粒、表達質(zhì)粒pET-28a(+)均由第二軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學教研室提供。骨肉瘤細胞株購自中國科學院上

9、海細胞生化研究所。    1.1.3  試劑：RNA抽提試劑盒為上?；瓷锕こ逃邢薰井a(chǎn)品。RT-PCR試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品。Pyrobest DNA聚合酶為Takara公司產(chǎn)品。限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶為MBI公司產(chǎn)品。質(zhì)粒抽提和膠回收試劑盒為Viogene公司產(chǎn)品。異丙基-D-硫代半乳糖苷酶（IPTG）為上海生工公司產(chǎn)品。Ni2+-NTA柱為Sigma公司產(chǎn)品。    1.2  方法    1.2.1  RT-PCR    1.2

10、.1.1  總RNA的提?。喝〕墒霺D大鼠心肌組織約150 mg，參考薩姆布魯克等4方法及RNA抽提試劑盒手冊，電動勻漿后行總RNA的提取。    1.2.1.2  cDNA的合成：參考RT-PCR試劑盒實驗手冊進行。RNA(1g/l)2.0l，dNTPs(5mM dNTP)2.0l，Oligo-dT引物（10 unit/l）1.0l，RNase抑制劑（10 unit）1.0l，逆轉(zhuǎn)錄酶（4 unit）1.0l，無RNase水加至20l。37 溫育60 min，然后90 溫育5 min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。-20 保存。 

11、60; 1.2.1.3  PCR擴增：參考GeneBank(gi:48255910)發(fā)表的序列及表達載體pET-28a(+)多克隆位點、應用DNAstar軟件設計引物，由上海生工公司合成。    上游引物： 5' TGCGAATTCATGCCTGGGAGCCCT 3'    EcoRI    下游引物： 5' GCAAACGTTGATCATCCCTGGTCACTG 3'    HindIII    取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0l為模板，按常規(guī)PCR反應條

12、件，先將樣品于94 變性5 min，加入2.5 u的Pyrobest DNA聚合酶，按下列參數(shù)循環(huán)35次：94 變性1 min，58 退火1 min，72 延伸40 s，最后一個循環(huán)后，72 延伸10 min，4 保存。    1.2.3  載體的構(gòu)建及DNA序列分析：將RT-PCR產(chǎn)物平端與用EcoR酶切過的pBSK(+)質(zhì)粒，回收后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，挑白斑培養(yǎng)抽提質(zhì)粒并進行初步酶切鑒定，選擇3株酶切合格質(zhì)粒送生工公司測序。把測序正確的質(zhì)粒用EcoRI和Hind雙酶切，膠回收后與預先經(jīng)EcoRI和Hind雙酶切的表達載體pET-28a(+)在連接酶作

13、用下相連接，構(gòu)建T7啟動子控制下的TIMP-4表達質(zhì)粒（見圖1）。將pET-28a(+)-TIMP-4表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。    1.2.4  重組克隆的誘導表達、純化和復性及鑒別：將pET-28a(+)-TIMP-4表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，接種單菌落至3 ml LB培養(yǎng)液中37 培養(yǎng)過夜，按2%的比例轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)液中（含50g/ml的卡那霉素），37 培養(yǎng)至A600條件下為0.61.0，加入IPTG（終濃度為1 mM/L），誘導35 h，離心收集菌體，進行SDS-PAGE蛋白電泳，薄層掃描檢測TIMP-4的表達情況

14、。誘導表達菌經(jīng)超聲破碎后，收集包涵體，用洗滌緩沖液洗滌，500 ml菌液制備的包涵體溶于20 ml溶解緩沖液。溶解后的蛋白用結(jié)合緩沖液透析24 h后進行純化。由于TIMP-4的N端融合了6×His，所以表達產(chǎn)物以Ni2+-NTA樹脂來純化。溶解的蛋白上預先以3倍柱體積結(jié)合緩沖液平衡的Ni2+-NTA柱后，先以10倍結(jié)合緩沖液洗滌，再分別以10倍柱體積的NTA-PH6.5 Buffer和NTA-PH5.80 Buffer洗脫雜蛋白。    直接在Ni2+-NTA柱上復性5。先用10倍柱體積的復性緩沖液A洗滌，再用15倍柱體積的復性緩沖液B洗滌。最后用洗脫緩沖液洗脫目

15、的蛋白。純化的TIMP-4經(jīng)蛋白質(zhì)濃度測定后，-70 保存。    Western blot分析鑒別：用10%丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳(每孔加TIMP-4純化融合蛋白20l)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，切取條帶后在4 條件下以的TIMP-4單克隆抗體(1:100 Sigma)孵育24 h，漂洗后以帶有辣根過氧化物酶的二抗37 孵育30 min，4-氯-1-萘酚（Sigma）顯色。    1.2.5  實驗操作方法：質(zhì)粒抽提、酶切反應、DNA片段回收、連接反應、細菌轉(zhuǎn)化、SDS-PAGE電泳等實驗操作均參照文獻4略加修

16、改進行。    1.2.6  TIMP-4蛋白對骨肉瘤細胞侵襲性影響的測定(微孔遷移技術(shù))：Boyden小室的構(gòu)建參照Mohyeldin A等6方法。用DMEM制備濃度為2×105個/ml的骨肉瘤細胞懸液，分成兩組：1組為對照組，另1組含濃度為20g/ml的TIMP-4蛋白，向小室中各加入細胞懸液100l，37 孵育24 h后將小室置于4%中性甲醛中固定20 min，存在于微孔濾膜上面的細胞用棉簽蘸95%乙醇輕輕擦去，侵襲至膜下的細胞用蘇木精和5%結(jié)晶紫染色，膜干燥后用剪刀將膜剪開，置于玻片上中性樹膠封片并計數(shù)，每張膜取上、下、左、右、中5個視

17、野，取均數(shù)，每種處理分別重復3次。取穿過膜的細胞相對數(shù)作為衡量細胞侵襲能力的指標，計算方法為：侵襲力=（1-實驗組侵襲細胞數(shù)/對照組侵襲細胞數(shù)）×100%。    1.3  統(tǒng)計學處理方法  采用t檢驗進行統(tǒng)計檢驗。    2 結(jié)果    2.1  TIMP-4基因的獲得  新生4 d SD大鼠心肌細胞組織總RNA，經(jīng)甲醛變性電泳，紫外檢測儀下可見完好的28 s，18 s rRNA，表明提取的總RNA質(zhì)量可靠，未出現(xiàn)降解。RT-PCR擴增得到大小

18、約680 bp的特異條帶，大小與預測結(jié)果一致（見圖2）?；厥沾似纹蕉丝寺∪胼d體pBSK(+)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)TG1，挑取重組子，經(jīng)EcoRI和Hind雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳（見圖3），表明插入片段大小與預測大小一致。對重組質(zhì)粒中插入片段測序，結(jié)果表明分離的TIMP-4基因序列與GeneBank(gi:48255910)發(fā)表的序列一致。    2.2  TIMP-4的誘導表達、純化及復性  采用IPTG誘導表達后發(fā)現(xiàn)，在分子量約23 kD處有顯著的蛋白表達條帶，該蛋白大小與理論計算值基本一致，凝膠自動掃描分析顯示，其占BL21細菌總蛋白的

19、23.5%，基本是以包涵體形式存在。將大量誘導的BL21細菌超聲破碎、洗滌、溶解、純化、復性后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色分析，除TIMP-4特異條帶外，基本無其他條帶，薄層掃描結(jié)果可見純度達90%以上，詳見圖4、圖5。經(jīng)過Western blot分析后顯示所取得的蛋白質(zhì)與TIMP-4抗體具有特異性作用，為TIMP-4蛋白（見圖6）。    2.3  TIMP-4的活性測定  Matrigel經(jīng)過重建后在聚碳酸酯膜表面形成類似天然基底膜結(jié)構(gòu)，對其的侵襲能力可以顯示出腫瘤細胞的侵襲力。本研究中顯示，TIMP-4融合蛋白使骨肉

20、瘤細胞侵入基底膜能力受到明顯影響，浸入的細胞數(shù)為（61.3±5.2）對照組為（80.5±7.6），其抑制率達到25.1%(見表1)。    3  討論    TIMP-4是1996年John Greene等7采用已表達序列標志(expressed sequence tag，EST)序列測定的方法研究MMP的抑制物TIMP時發(fā)現(xiàn)的，屬于TIMP家族成員中的一員，根據(jù)發(fā)現(xiàn)的先后順序而被命名為TIMP-4。后來通過免疫組化、Northen-Blot，RT-PCR及原位雜交等方法來研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-4的組織表達相當局限，

21、在腎臟、胰腺、結(jié)腸及直腸中的表達量非常低，在肝臟、腦、肺、甲狀腺、小腸等組織中基本無表達，但在心臟有大量的轉(zhuǎn)錄和翻譯。鑒于此，我們選擇用成熟SD大鼠的心肌細胞作為基因的組織來源，參考GeneBank(gi:48255910)發(fā)表的序列，應用DNAstar生物軟件設計引物，用RT-PCR方法分離到了TIMP-4目的基因，經(jīng)序列測定顯示分離得到的TIMP-4目的基因與文獻報道一致。這意味著在SD大鼠的心肌細胞中確實有TIMP-4 mRNA表達，并且該研究中所采用的引物設計正確且條件合適。研究中把分離到的目的基因克隆至pET-28a(+)表達載體，以大腸桿菌BL21為宿主菌進行表達，發(fā)現(xiàn)在BL21中

22、TIMP-4的表達量可占全菌總蛋白的23.5%，且基本上是以包涵體的形式存在。由于TIMP-4的N端融合了6His，所以表達產(chǎn)物在溶解后采用N2+-NTA柱來純化。    本研究中采用直接在N2+-NTA柱上進行復性，使傳統(tǒng)的透析復性、稀釋復性等方法存在的效率低、損失量大的缺點得到了很大的克服。用獲得的TIMP-4蛋白加入培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)，TIMP-4蛋白對骨肉瘤的侵襲力產(chǎn)生了較大的影響，抑制率達到25.1%，這意味著所獲得的TIMP-4蛋白具有抑制骨肉瘤侵襲能力的生物學活性，從而為后續(xù)的TIMP-4的結(jié)構(gòu)和功能研究提供了基礎?！緟⒖嘉墨I】  1 蔣曉山,

23、黃信孚, 李吉友, 等. 金屬蛋白酶組織抑制物與乳腺癌轉(zhuǎn)移及預后的關(guān)系J. 中華外科雜志, 2000, 38(4):291- 293.2 Fisher KE, Pop A, Koh W,et al. Tumor cell invasion of collagen matrices requires coordinate lipid agonist-induced G-protein and membrane-type matrix metalloproteinase-1-dependent signalingJ. Mol Cancer, 2006, 5(12):69.3 Cao J, Chiarelli C, Kozarekar P, et al.