小鼠Foxp3抗血清的制備及應(yīng)用

1、小鼠Foxp3抗血清的制備及應(yīng)用 11-01-31 14:13:00 編輯：studa20 作者：焦海春, 肖建華*, 何濤君, 胡杰, 崔彥芬【摘要】 目的: 制備高效價(jià)的特異性小鼠Foxp3抗血清, 并初步應(yīng)用于正常小鼠組織的Foxp3表達(dá)的鑒定。方法: 構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX6p2/Foxp3, 并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá), 用純化的重組融合蛋白免疫新西蘭兔, 制備抗血清。以制備的抗血清為一抗, Western blot檢測(cè)小鼠組織的Foxp3蛋白的表達(dá)。結(jié)果: SDSPAGE及Western blot鑒定, 誘導(dǎo)表達(dá)及純化的重組融合蛋白能被抗GST單克隆抗

2、體（mAb）識(shí)別, 在Mr 45000附近有特異條帶, 與預(yù)期融合蛋白大小一致, 獲得的抗血清效價(jià)在112800以上, 該抗血清能特異性識(shí)別NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)的Foxp3蛋白。Western blot鑒定結(jié)果顯示在脾臟、 胸腺、 淋巴結(jié)中Foxp3蛋白有較高表達(dá), 胃也有少量的表達(dá), 而骨骼肌、 脂肪組織未見(jiàn)表達(dá)。結(jié)論: 制備了高效價(jià)的特異性小鼠Foxp3抗血清, 并可用于正常小鼠組織的Foxp3蛋白的表達(dá)鑒定, 為進(jìn)一步研究Foxp3奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 Foxp3 CD4+CD25+Treg細(xì)胞 抗血清制備Abstract AIM: To prepare the high ti

3、ter and specific antiserum against mouse Foxp3 and then use them to identify Foxp3 expression in normal mouse tissues. METHODS: The Foxp3 fragment was amplified by polymerase chain reactions(PCR) and cloned into the prokaryotic expression vector pGEX6p2. The recombinant plasmid pGEX6p2/Foxp3 was tra

4、nsformed into E.coli BL21(DE3) to be expressed. The expressed fusion protein GSTFoxp3 was analyzed by SDSPAGE and Western blot. The polyclonal clantiserum was obtained by immunizing New Zealand rabbits with the purified fusion protein as antigen. The Foxp3 expression in normal mouse tissues was dete

5、cted by Western blot with the antiserum. RESULTS: The expressed products were analyzed by SDSPAGE and Western blot. The results showed that the molecular weight of the expressed protein was about 45 000. The titer of the antiserum was above 112 800. We observed that the antiserum could recognize Fox

6、p3 protein expressed in NIH3T3 cells by immunoblotting. Western blot results showed that the Foxp3 protein was expressed highly in spleen, thymus and lymph nodes, less expressed in stomach, but not expressed in skeletal muscle and adipose tissue. CONCLUSION: High titer antiserum against mouse Foxp3

7、is produced and can be used to identify the Foxp3 expression in normal mouse tissues.KeywordsFoxp3; CD4+CD25+Treg cell; antiserum preparation1995年, Sakaguchi等1發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（regulatory T cell, Treg）后, 該細(xì)胞的研究成了近年來(lái)免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。人們發(fā)現(xiàn), Treg在自身免疫病、 抗感染免疫、 腫瘤免疫、 移植物耐受等方面都具有重要意義。Foxp3基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子forkhead/w

8、ingedhelix家族, 該基因家族由大量分布極廣的轉(zhuǎn)錄因子組成, 該家族成員具有共同的保守序列“叉狀頭/翅膀狀螺旋”DNA結(jié)合域。在Scurfy小鼠和人類(lèi)IPEX綜合征（immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, Xlinked syndrome）中發(fā)現(xiàn)Foxp3基因的突變, Scurfy小鼠和IPEX中均出現(xiàn)Treg的數(shù)量及功能異常2。2003 年,研究證明轉(zhuǎn)錄因子Foxp3不僅在Treg上特異性表達(dá), 而且對(duì)Treg的發(fā)育和功能是必需的3, 4。OGarra等5稱(chēng)其為21世紀(jì)分子, 可以知道其在免疫調(diào)節(jié)中起到不可忽視的作

9、用。目前對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的研究還處于初級(jí)階段, 對(duì)其在體內(nèi)的作用, 尤其是分子效應(yīng)機(jī)制方面了解還甚少。因此, 我們制備了高效價(jià)的特異性小鼠抗Foxp3血清, 并對(duì)正常小鼠組織進(jìn)行了檢測(cè), 對(duì)制備的抗血清進(jìn)行了初步應(yīng)用。1 材料和方法1.1 材料 pGEX6p2表達(dá)載體、 E.coli BL21、 E.coli XL1blue、 NIH3T3 細(xì)胞、 GST純化蛋白為本研究所保存。pMIGR1/Foxp3重組質(zhì)粒和pMIGR1質(zhì)粒由Sakaguchi S教授(Kyoto University, Japan)贈(zèng)送。純種雄性新西蘭兔、 清潔級(jí)昆明小鼠為南華大學(xué)動(dòng)物部飼養(yǎng)。限制性內(nèi)切酶EcoR I

10、和Xhol I、 T4 DNA連接酶、 Taq酶、 DNA標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas公司; P7708V蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為紐英倫公司產(chǎn)品; GST瓊脂糖凝膠FF純化柱購(gòu)自北京天來(lái)公司; 弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司; ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自PIERCE公司; 引物由上海生工技術(shù)服務(wù)公司合成。1.2 方法1.2.1 抗原表位的選擇 從GenBank(/entrez)中獲取小鼠Foxp3基因(NM: 054039)的堿基序列及氨基酸序列, 用ExPasy網(wǎng)上軟件作抗原表位分析(網(wǎng)址: www.ExP), Blast軟件分析選取與Fox

11、p家族(Foxp1、 Foxp3、 Foxp2、 Foxp4)中的其他成員相比較特異的一段氨基酸序列, 綜合以上指標(biāo), 選擇抗原性較強(qiáng)的抗原表位區(qū)Foxp3區(qū)段(178336aa)的編碼基因片段(5321008bp)為目的基因。1.2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)基因庫(kù)提供的Foxp3編碼基因序列, 設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物。上游引物P1: 5CCGAATTCGGAAAGACCCAGCCAACCTT3, 引入EcoR I酶切位點(diǎn); 下游引物P2: 5GGCCTCGAGCATATTGTGGTACTTGAAG3, 引入Xhol I酶切位點(diǎn)。以pMIGR1/Foxp3重組質(zhì)粒為模板, PCR擴(kuò)增目的基因

12、, 94 5 min預(yù)變性后, 進(jìn)入94 30 s, 61 45 s, 72 45 s的循環(huán), 共計(jì)30次, 末次循環(huán)后72延伸7 min終止反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖電泳鑒定, 通過(guò)DNA純化系統(tǒng)回收。1.2.3 PCR產(chǎn)物的亞克隆 純化回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xhol I雙酶切消化, 再次純化回收后, 亞克隆到經(jīng)同樣的雙酶酶切消化然后純化回收的原核表達(dá)載體pGEX6p2上。經(jīng)PCR篩選, EcoR I酶和Xhol I酶雙酶切鑒定后核苷酸序列測(cè)序鑒定。1.2.4 重組融合蛋白的表達(dá)、 純化及鑒定 取500 mL IPTG（終濃度為0.1 mmol/L） 20誘導(dǎo)6 h

13、的菌液離心收集菌體, 加入細(xì)胞裂解液, 反復(fù)凍融后超聲破菌, 離心收集上清, 用GST瓊脂糖凝膠FF純化柱純化。采用紫外吸收法測(cè)定純化蛋白濃度, 并進(jìn)行SDSPAGE分析。以鼠抗人GST mAb為一抗, Western blot鑒定重組融合蛋白。 Western blot鑒定參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第3版）實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行。1.2.5 兔抗小鼠Foxp3多克隆血清的制備 選質(zhì)量4.0 kg的雄性新西蘭兔, 于背部皮下多點(diǎn)注射純化的重組融合蛋白500 g, 共4次, 同時(shí)設(shè)GST、 PBS對(duì)照組為陰性對(duì)照。第1次加等量完全弗氏佐劑, 后3次加入等量不完全弗氏佐劑, 每次間隔10 d。第4次免疫10 d

14、后耳緣靜脈采血, 離心分離血清, 檢測(cè)血清特異性抗體, 并測(cè)定血清抗體滴度（免疫前的血清作為陰性對(duì)照）, 若抗體效價(jià)達(dá)到要求, 心臟采集兔全血, 離心分離血清, 并加入純化的GST蛋白以封閉血清中的GST抗體, 分裝成小份保存于-20待用。1.2.6 兔抗小鼠Foxp3血清的特性鑒定 (1)效價(jià)測(cè)定: 采用ELISA法, 用純化的GSTFoxp3重組融合蛋白包被酶標(biāo)板, 4包被過(guò)夜, 兔血清稀釋度從1100到151200, 羊抗兔IgGHRP(110000稀釋)為二抗, 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色, 酶標(biāo)儀檢測(cè)A450值, 以免疫前兔血清作陰性對(duì)照, 結(jié)果以待測(cè)標(biāo)本A450值/陰性對(duì)照A450

15、值2.1為陽(yáng)性, 以出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度作為血清的效價(jià)。(2)特異性鑒定: 利用電穿孔法分別轉(zhuǎn)染pMIGR1/Foxp3及pMIGR1入NIH3T3細(xì)胞, 提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白, SDSPAGE分析, 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。Western blot鑒定, 一抗為兔免疫血清（11000稀釋?zhuān)? 二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（14000稀釋?zhuān)? 發(fā)光法檢測(cè)NIH3T3轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的Foxp3蛋白。1.2.7 正常小鼠組織的Foxp3蛋白的表達(dá)鑒定 提取昆明小鼠脾臟、 胸腺、 腹股溝淋巴結(jié)、 胃、 骨骼肌、 脂肪組織的總蛋白, 以處理的小鼠Foxp3抗血清為一抗進(jìn)行Western blo

16、t鑒定。2 結(jié)果2.1 重組質(zhì)粒pGEX6p2/Foxp3的鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Xhol I雙酶切及PCR鑒定, 結(jié)果經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析可見(jiàn), 酶切后出現(xiàn)了質(zhì)粒大片段和477 bp左右的小片段, 以重組質(zhì)粒為模板的PCR擴(kuò)增亦得到了477 bp左右的片段, 與目的片段大小相符（圖1）。序列測(cè)定結(jié)果與GenBank上序列(NM054039)完全一致。圖1 重組質(zhì)粒pGEX6p2/Foxp3的酶切及PCR鑒定（略）Fig 1 Identification of recombinant plasmid pGEX6p2/Foxp3 with restrictive enzyme digestion