皮膚鱗狀細胞癌組織和細胞系中Ptch1及Gli1表達的檢測

1、皮膚鱗狀細胞癌組織和細胞系中Ptch?1及Gli?1表達的檢測    【摘要】  目的：探討Hedgehog信號傳導通路中Ptch?1和Gli?1在鱗狀細胞癌皮損和細胞系中的表達及意義. 方法：采用免疫組化技術(shù)分別檢測鱗狀細胞癌皮損和細胞系A(chǔ)431,HSQ?89,HSC?2和Tca中Ptch?1和Gli?1的蛋白水平表達與分布. 結(jié)果：Ptch?1及Gli?1在正常皮膚，鱗狀細胞癌皮損，細胞系A(chǔ)431，HSQ?89以及HSC?2細胞中均有陽性表達，主要分布在鱗狀細胞癌細胞胞膜及胞質(zhì)中. 結(jié)論：鱗狀細胞癌皮損和細胞系中Ptch?1及Gli?1的陽

2、性表達可能通過激活Hedgehog信號傳導通路有助于鱗狀細胞癌的形成和發(fā)展. 【關(guān)鍵詞】  Hedgehog基因；信號傳導通路；免疫組化；癌,鱗狀細胞【Abstract】 AIM: To investigate the expressions and significance of Ptch?1 and Gli?1 in the squamous cell carcinoma lesions and the cell lines. METHODS: Immunohistochemical techniques were employed to detect the distribut

3、ion and expressions of Ptch?1 and Gli?1 in squamous cell carcinoma lesions and A431, HSQ?89, HSC?2 and Tca squamous cell carcinoma cell lines. RESULTS: There were significant expressions of Ptch?1 and Gli?1 in the squamous cell carcinoma lesions, normal tissue and in A431, HSQ?89 and HSC?2 squamous

4、cell carcinoma cell lines,and they were mainly distributed in the cell membrane and cytoplasma. CONCLUSION: Expressions of Ptch?1 and Gli?1 might contribute to formation and progression of squamous cell carci?noma via activating Hedgehog signaling pathway.【Keywords】 Hedgehog; signal transduction pat

5、hway; immunohistochemistry; carcinoma, squamous cell0  引言    皮膚鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）是皮膚科臨床上常見的表皮腫瘤之一,近年來其發(fā)病率明顯上升.雖然SCC的發(fā)生與基因突變及烴類化學物質(zhì)的接觸等因素相關(guān)1,但迄今為止,SCC的發(fā)病機制尚未完全闡明.既往研究顯示,Hedgehog（Hh）信號傳導通路在SCC發(fā)病中有可能起著重要作用2.為進一步探討Hh信號傳導通路與SCC之間的關(guān)系,我們運用免疫組化方法，觀察SCC皮損和多種SCC細胞系Hh信號轉(zhuǎn)導途徑

6、的靶基因Gli?1和 Patched?1(Ptch?1)的表達情況.1  材料和方法.1  材料  2004/2006經(jīng)西京醫(yī)院皮膚科臨床和病理確診為皮膚SCC存檔蠟塊30（男19，女11）例,年齡5176(平均66.2±4.6）歲. 選取15例正常皮膚組織作為正常對照組. Tca人SCC細胞株（第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院全軍皮膚病研究所實驗室保存）；A431人SCC細胞株（中國上海中科院細胞庫）；HSQ?89，HSC?2人SCC細胞株（日本Reken Cell Bank）；DMEM(Gibco公司)；胎牛血清（杭州四季青公司）；二甲基亞砜（西安化學試劑廠）；

7、倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Ptch?1和Gli?1抗體 (美國Santa Cruz公司)，兩種抗體的工作濃度均為1200.免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒（北京中杉公司）.1.2  方法  免疫組化采用ABC法,石蠟切片脫蠟,梯度乙醇至水,PBS洗3次，30 mL/L H2O2?甲醇室溫浸泡510 min，枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）進行抗原微波加熱修復(fù)60 min,冷卻至室溫后用150的正常馬血清室溫孵育20 min, 加20 mL/L BSA稀釋至1200的一抗Gli?1和Ptch?1置于濕盒內(nèi)，4冰箱孵育過夜（12 h）.分別加20 mL/L BSA稀釋

8、至1200生物素標記的抗山羊和抗兔二抗, 37孵育30 min, DAB顯色,顯微鏡下觀察,適時終止反應(yīng),蘇木精復(fù)染1530 s，脫水、透明、封片后，光鏡下觀察，每組實驗均以已知陽性切片（基底細胞癌）作陽性對照,分別以PBS溶液代替一抗做陰性對照.    將Tca，A431，HSQ?89和HSC?2細胞以5×104/孔接種在鋪有載玻片的培養(yǎng)皿中,37在CO2孵箱中培養(yǎng)過夜，分別用含0.5 mL/L新生小牛血清的DMEM (Tca)，高糖DMEM(A431，HSQ?89，HSC?2)同步化2 d,用冷丙酮固定細胞15 min,PBS洗滌5 min×

9、;3次，空氣中自然晾干；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；30 mL/L H2O2?甲醇室溫孵育510 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;PBS沖洗2 min共3次；50100 mL/L正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min. 傾去血清，勿洗，加20 mL/L BSA稀釋至1200的一抗Gli?1和Ptch?1置于濕盒內(nèi)，4過夜；PBS沖洗2 min共3次；滴加150稀釋的生物素標記的二抗，37孵育30 min；PBS沖洗2 min共3次. 顯色劑顯色（DAB）,自來水充分沖洗，復(fù)染、脫水、透明、封片. 用PBS代替一抗做陰性對照，用已知陽性片做陽性對照. 免疫組化結(jié)果SCC細胞胞質(zhì)或胞膜

10、著棕黃色為陽性. 隨機選取4個非連續(xù)的高倍鏡視野計數(shù)，評分標準按染色強度及陽性細胞數(shù)來計算評分1： 染色強度：0為陰性，1為弱陽性，2為陽性，3為強陽性； 陽性細胞計數(shù)：0為無陽性細胞，1為陽性細胞數(shù)10，2為陽性細胞數(shù)1050，3為陽性細胞數(shù)50. 之和為最后得分，得36分者為免疫組化染色陽性.    統(tǒng)計學處理: 采用SPSS 13.3統(tǒng)計軟件處理進行2驗檢, P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.2  結(jié)果2.1  Gli?1和Ptch?1在SCC組織中的表達  正常皮膚組織中Gli?1陰性14例，陽性1例，4例基底細胞癌均陽性

11、. 皮膚組織中Gli?1陽性18例（60.0，18/30）,陰性12例,陽性染色仍定位于胞質(zhì). 正常皮膚組織中Ptch?1陰性13例,陽性2例,皮膚組織中Ptch?1陽性19例（63.3，19/30）,陰性11例,陽性染色定位于胞質(zhì)，差異均有統(tǒng)計學意義（1:2=11.66,P<0.01;2：2=10.04, P<0.01,圖1).2.2  Gli?1和Ptch?1在SCC細胞株中的表達  Gli?1和Ptch?1在細胞株A431，HSQ?89和HSC?2細胞中均呈陽性表達,Gli?1蛋白在A431細胞株和HSQ?89細胞株中陽性染色定位于胞漿,在HSC?2細胞株

12、中Gli?1陽性染色定位于胞質(zhì),部分胞膜也有陽性染色. 而在Tca細胞株中Gli?1蛋白未見表達（圖2）.Ptch?1蛋白在A431細胞株和HSQ?89細胞株中陽性染色定位于胞質(zhì),而在HSC?2細胞株和Tca細胞株中均未見表達（圖3）.A: Gli?1; B: Ptch?1.圖1  Gli?1和Ptch?1在鱗狀細胞癌組織中的表達  SP ×400（略）A: A431; B: HSQ?89; C: HSC?2; D: Tca.圖2  Gli?1在鱗狀細胞癌細胞中的表達  SP ×400（略）A: A431; B: HSQ?89; C:

13、 HSC?2; D: Tca.圖3  Ptch?1在鱗狀細胞癌細胞中的表達  SP ×400（略）3  討論    Hh信號通路是一個高度保守的調(diào)控胚胎發(fā)育的信號通路,在胚胎發(fā)育過程中起著十分重要的作用, 參與了人類一些腫瘤的發(fā)生與發(fā)展2，Hh 信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)分子的突變可導致腫瘤的形成,如基底細胞癌、鱗狀細胞癌等3-4.目前關(guān)于Hh信號轉(zhuǎn)導通路在基底細胞癌中的重要作用已經(jīng)得到國內(nèi)外學者的公認5. Hh信號轉(zhuǎn)導通路由十數(shù)個分子組成,我們之所以選用Ptch?1和 Gli?1作為研究對象,是因為在既往研究中已充分證實Ptch?1

14、和Gli?1是Hh信號轉(zhuǎn)導通路中起關(guān)鍵作用的結(jié)點之一：Ptch?1不僅是Hh信號的受體,同時是Hh信號轉(zhuǎn)導通路的目的基因,是該信號傳導通路重要的負反饋調(diào)節(jié)因子,Ptch?1基因失活與許多先天性疾病及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)；而 Gli?1是Hh信號轉(zhuǎn)導通路下游的一個重要因子,起著承上啟下關(guān)鍵性的調(diào)控作用,Gli?1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及惡性維持中的作用不容忽視6.既往研究發(fā)現(xiàn),在皮膚SCC皮損中有Ptch?1和Gli?1的表達,免疫組化及原位雜交結(jié)果均顯示陽性顆粒主要分布于SCC細胞胞質(zhì)中,胞核無明顯著色7. 有學者發(fā)現(xiàn)在SCC細胞系A(chǔ)431和KA中發(fā)現(xiàn)有Patched mRNA的突變,細胞系HSQ?89

15、,Ho?1u?1和T3M?1 Clone?2中有Shh,Patch,Smo和Gli的表達,但是在細胞系Tca,HSC?4,Sa3,SCCTF,SCCTF和SCCKN中未有陽性表達8-9.我們用免疫組織化學的方法檢測了皮膚SCC皮損中Ptch?1和Gli?1的表達情況, 再次驗證了SCC皮損中Hh信號轉(zhuǎn)導通路處于激活狀態(tài).我們發(fā)現(xiàn),在SCC皮損中,Ptch?1和Gli?1陽性表達增強,陽性表達部位主要是癌細胞胞質(zhì)中,在腫瘤組織的血管內(nèi)皮細胞中也有部分陽性著色.檢測Hh信號轉(zhuǎn)導通路在多種皮膚SCC細胞系中的表達結(jié)果顯示,4個皮膚SCC細胞系中有3個細胞系呈陽性表達,Gli?1蛋白在A431細胞系和

16、HSQ?89細胞系中在胞漿表達,在HSC?2細胞系中主要在胞質(zhì)表達,部分胞膜也有表達,而在Tca細胞系中Gli?1蛋白未見表達.Ptch?1蛋白在A431細胞系和HSQ?89細胞系中主要在胞質(zhì)表達,而在HSC?2細胞系和Tca細胞系中均未見表達. 這些結(jié)果均提示在皮膚SCC皮損和細胞系中Hh信號轉(zhuǎn)導通路處于激活狀態(tài),為進一步深入研究Hh信號轉(zhuǎn)導通路在SCC發(fā)病及治療中的作用提供了依據(jù).【參考文獻】  1 Potti A, Moazzam N, Langness E, et al. Immunohistochemical determination of HER?2/neu, c?ki

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