特異性DC疫苗治療慢性乙型肝炎療效及治療后血清ICAM-1、ICAM-3水平的研究

1、特異性DC疫苗治療慢性乙型肝炎療效及治療后血清ICAM-1、ICAM-3水平的研究         【摘要】  目的檢測(cè)特異性DC疫苗治療慢性乙型肝炎患者前后HBV-DNA的變化，及治療后療效好與療效差者血清ICAM-1、ICAM-3的水平的變化，探討DC疫苗療效及其影響因素。方法選取慢性乙型肝炎患者37例，抽取患者外周血，分離樹(shù)突細(xì)胞行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增后以表面抗原致敏，制備成特異性DC疫苗，自體回輸，回輸2次為1個(gè)療程（間隔2周），每位患者均治療2個(gè)療程。檢測(cè)治療前后患者HBV-DNA的變化，檢測(cè)治療后療

2、效好與差者血清ICAM-1、ICAM-3水平的變化。結(jié)果37例慢性乙型肝炎患者經(jīng)DC疫苗治療后，19例HBV-DNA載量下降2.0log10,18例HBV-DNA載量下降2.0log10,有效率51.4%（2=25.56,P0.001）。血清ICAM-1、ICAM-3水平，在有效與無(wú)效兩組間比較差異無(wú)顯著性（P0.05）。結(jié)論特異性DC疫苗治療慢性乙型肝炎，可顯著降低HBV-DNA載量，ICAM-1、ICAM-3可能不是影響其療效的主要因子。 【關(guān)鍵詞】  特異性DC疫苗 ICAM 樹(shù)突細(xì)胞 乙型肝炎   【Abstract】ObjectiveTo observe

3、 the efficacy and changes of HBV-DNA, ICAM-1 and ICAM-3  in chronic hepati-tis B patients treated with specific DC vaccine. MethodsThe subjects were taken peripheral blood dendritic cells from 37 chronic hepatitis B patients, DCs were cultured and proliferated in vitro with HBsAg to prepare the

4、 specific DC vaccine, and transfused twice for a course of treatment （interval 2 weeks）. After two courses of treatment, changes of HBV-DNA, ICAM-1 and ICAM-3 were observed. ResultsAfter DC transfusion, the levels of HBVDNA in 19 cases were decreased2.0 log 10. The effective rate was 51.4% （2=25.56,

5、 P0.001）. There was no obvious differences in levels of ICAM-l and ICAM-3 （P0.05）. ConclusionSpecific DC vaccine can obviously decrease the level of HBV-DNA. Perhaps ICAM-1 and ICAM-3 are not the main factors.   【Key words】specific DC vaccine; cell adhesion molecules; dendritic cells; hepa

6、titis B   自1970年至今，隨著樹(shù)突細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)及對(duì)樹(shù)突細(xì)胞（DC）的體外分離、擴(kuò)增和培養(yǎng)技術(shù)方面的基礎(chǔ)研究，DC用于乙型肝炎的治療在動(dòng)物、體外及臨床試驗(yàn)中，取得了很好的療效13。目前已經(jīng)成為臨床研究的一個(gè)“熱點(diǎn)”，但在臨床的應(yīng)用中仍缺乏有力的依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增慢性乙型肝炎患者外周血的DC，以HBsAg致敏，制成特異性DC疫苗，經(jīng)皮下行自體回輸，觀察特異性DC疫苗治療前后患者HBV-DNA及治療后血清ICAM-1、ICAM-3水平，判定DC治療慢性乙型肝炎的療效，通過(guò)對(duì)特異性DC疫苗治療后療效好與療效差的慢性乙型肝炎患者血清ICAM-1、ICAM-

7、3水平的比較，了解其是否為影響DC疫苗療效的主要因子。為臨床DC治療慢性乙型肝炎提供理論依據(jù)。   1材料與方法   1.1材料   1.1.1研究對(duì)象選取2004年5月2007年5月河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院肝病中心門(mén)診或住院慢性乙型肝炎患者37例，其中男30例，女7例；年齡1863歲，平均37歲。所有病HBV-DNA均1.0×105copies/ml。入選患者無(wú)其他病毒合并感染及嚴(yán)重并發(fā)癥，治療前半年內(nèi)未使用過(guò)任何抗病毒及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的藥物，全部獲得了知情同意。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年修訂的病毒性肝炎防治方案4及2005年慢性乙

8、型肝炎防治指南。   1.1.2主要試劑   1.1.2.1DC疫苗制備試劑rhGM-CSF、rhIL-4、RPMI1640培養(yǎng)液、鼠抗人CD40，CD83，購(gòu)于河北博海生物工程有限公司，HBsAg購(gòu)于中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所。   1.1.2.2ELISA試劑ICAM-1、ICAM-3 ELISA試劑盒，國(guó)外生產(chǎn)國(guó)內(nèi)組裝，試劑號(hào)分別為EIA05821，QRCT-225998EIA/UTL。   1.1.2.3主要儀器CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma,美國(guó)），倒置顯微鏡（Olympus,日本），可在450mm

9、處進(jìn)行計(jì)數(shù)的全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo,芬蘭），37恒溫箱（SBHW-IV，北京），可調(diào)多道移液器及槍頭（EPPENDORF，德國(guó)），離心機(jī)（LD-25-2，北京），振蕩混勻器（XW-80A，上海）。   1.2實(shí)驗(yàn)方法采用自身前后對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在無(wú)菌條件下抽取受試者外周靜脈血20ml，肝素抗凝，在百級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下面操作：生理鹽水1：1稀釋抗凝血，層加到淋巴細(xì)胞分離液2000r/min離心30min，分離出外周血單核細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用1640液選2次，再加入含有體積分?jǐn)?shù)150ml/L入AB血清的1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以2×109/L的細(xì)胞濃度加入一次性6孔培養(yǎng)板中，

10、于37 50ml/L CO2 飽和濕度下培養(yǎng)4h,棄上清液，再用1640培養(yǎng)液輕洗2次，除去非貼壁細(xì)胞，加入含8335Kat/L rhGM-GSFt 8335kat/L rhIL-4的完全培養(yǎng)基，隔日換液，培養(yǎng)至第6天再加入終濃度為2.5mg/L的HBsAg，4h后加入終濃度為10g/L的TNF，繼續(xù)在37 50ml/L CO2飽和濕度下培養(yǎng)1天，收獲DC用生理鹽水洗滌2次并計(jì)數(shù)，即刻在受試者腋下部位常規(guī)消毒后經(jīng)皮下注入體內(nèi)。同時(shí)取細(xì)胞洗液做無(wú)菌實(shí)驗(yàn)?；剌?次為1個(gè)療程（間隔2周），每名患者均治療2個(gè)療程。分別檢測(cè)治療前及治療結(jié)束1月后患者HBV-DNA。留取患者治療結(jié)束后的血清，凍存于-86

11、冰箱。用ELISA法集中檢測(cè)ICAM-1、ICAM-3。   1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料用x±s表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)、計(jì)量資料進(jìn)行2檢驗(yàn)，全部資料均用SAS8.1軟件處理。            2結(jié)果   2.1DC疫苗治療前后病毒學(xué)應(yīng)答情況37例患者DC治療前后HBV-DNA下降2.0log10的19例，有效率51.4%。見(jiàn)表1。表1DC疫苗治療前后病毒學(xué)應(yīng)答情況   2.2回輸后血清ICAM-1、ICAM-3的水平見(jiàn)表2、表3

12、。DC治療后有效者19例，無(wú)效者18例，對(duì)兩組間ICAM-1、ICAM-3分別進(jìn)行T檢驗(yàn)，ICAM-1方差齊性檢驗(yàn)：P=0.13720.1,方差齊。T檢驗(yàn)：t=0.33,DF=31,P=0.74210.05,差異無(wú)顯著性。ICAM-3方差齊性檢驗(yàn)：P=0.12230.1,方差齊。T檢驗(yàn)：t=1.49,DF=31,P=0.14750.05,差異無(wú)顯著性。表2DC疫苗治療后血清ICAM-1水平在兩組間比較 表3DC疫苗治療后血清ICAM-3水平兩組間比較   3討論   樹(shù)突細(xì)胞（dendritic cells,DC）是由美國(guó)學(xué)者Steinman于1973年

13、發(fā)現(xiàn)的，是目前所知的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞57。DC是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有獨(dú)特的地位。它是抗原與T細(xì)胞之間的“橋梁”，可通過(guò)MHC類和類分子遞呈病毒肽，從而激活CD4+T、CD8+T細(xì)胞。但在慢性乙型肝炎病人中，DC在數(shù)量以及功能上都存在不同程度的改變，抗原提呈及分泌細(xì)胞因子等功能受到不同程度的抑制。DC的質(zhì)量及功能的改變會(huì)導(dǎo)致Th1/Th2失衡及細(xì)胞免疫功能低下，這是引起HBV感染慢性化發(fā)生的主要原因8。在實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增慢性乙型肝炎患者外周血的DC，以HBsAg致敏，制成特異性DC疫苗，經(jīng)皮下行自體回輸，觀察特異性DC疫苗治療前后患者HBV-DN

14、A變化，發(fā)現(xiàn)37例慢性乙型肝炎患者中19例病毒載量下降2.0log10，有效率51.4%（2=25.56,P0.001）。提示特異性DC疫苗可有效降低慢性乙型肝炎患者的病毒載量，為治療慢性乙型肝炎的有效方法之一。粘附分子（cell adhesion molecules,CAM）是眾多介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱。CMA以受體-配體結(jié)合的形式發(fā)揮作用，使細(xì)胞與細(xì)胞間，細(xì)胞與基質(zhì)間，或細(xì)胞-基質(zhì)-細(xì)胞間發(fā)生粘附，參與細(xì)胞的識(shí)別，細(xì)胞的活化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞的增殖與分化，細(xì)胞的伸展與移動(dòng)，是免疫應(yīng)答、炎癥發(fā)生、凝血、腫瘤轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)傷愈合等一系列重要生理和病理過(guò)程的分子基礎(chǔ)。根

15、據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為整合素家族、選擇素家族、免疫球蛋白超家族、鈣粘蛋白家族及一些尚未歸類的粘附分子。主要功能為：（1）免疫細(xì)胞識(shí)別中的輔助受體和協(xié)同活化信號(hào)；（2）炎癥過(guò)程中白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附；（3）淋巴細(xì)胞歸巢等。ICAM-1及ICAM-3隸屬于免疫球蛋白超家庭，ICAM-3是體內(nèi)重要的協(xié)同刺激分子，介導(dǎo)T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞（APC）細(xì)胞之間的粘附及參與樹(shù)突細(xì)胞與T細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)T細(xì)胞早期活化、粘附和增殖，在乙型肝炎的免疫過(guò)程中亦為重要角色。本實(shí)驗(yàn)顯示DC治療后血清中ICAM-1、ICAM-3在有效與無(wú)效兩組間比較差異無(wú)顯著性（P0.05）。這與部分文獻(xiàn)描述不相符9，10，提示ICA

16、M-1、ICAM-3可能不是影響DC疫苗治療慢性乙型肝炎療效的主要因子，或是由于觀察例數(shù)較少，或由于患者個(gè)人體質(zhì)的差別等因素造成。人體免疫系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，應(yīng)進(jìn)一步做多因素研究，了解免疫細(xì)胞、免疫因子等諸多因素之間的交互作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1蒲驍麟，束永前，張錦英.抗原負(fù)載的樹(shù)突細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的影響.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，15（1）：6-9.2李用國(guó)，羅云萍，蘭英華，等.樹(shù)突細(xì)胞HBsAg疫苗抗乙型肝炎病毒免疫的體外研究.中華傳染病雜志，2002，20（6）：333-336.3佟立新，劉樹(shù)賢，郭力紅，等.自體樹(shù)突細(xì)胞聯(lián)合抗病毒治療對(duì)HBV慢性感染者的臨床效應(yīng)

17、.世界華人消化雜志，2007，15（11）：1232-1236.4中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì).病毒性肝炎防治方案.中華肝臟病雜志，2000，8：324-329.5王全楚，聶青和.樹(shù)突狀細(xì)胞.實(shí)用肝臟病雜志，2003，6（3）：151.6羅道升.樹(shù)突細(xì)胞相關(guān)基礎(chǔ)研究進(jìn)展.國(guó)外醫(yī)學(xué)·免疫學(xué)分冊(cè)，2005，28（1）：51-55.7Sk Md Fazle Akbar,Norio Horiike,Morikazu Onji.Immune therapy including dendritic cell based therapy in chronic hepatitis B virus infection.World J Gastronterol,2006,12（18）:2876-2883.8辛永寧，宣世英，孫櫻.慢性乙型肝炎TH1/TH2細(xì)胞的免疫功能研究進(jìn)展.臨床肝膽病雜志，2005，2