紅樹植物鹵蕨內(nèi)生真菌Penicillium sp. 0935030中的抗菌活性成分研究

1、紅樹植物鹵蕨內(nèi)生真菌Penicillium sp. 0935030中的抗菌活性成分研究作者：崔海濱 梅文莉 繆承杜 林海鵬 洪葵 戴好富【摘要】為研究紅樹林植物鹵蕨(Acrostichum aureurm)內(nèi)生真菌Penicillium sp.0935030發(fā)酵物中的抗菌活性成分，采用活性追蹤的方法，用多種色譜技術對化合物進行分離純化，通過理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)鑒定出7個化合物，分別為：環(huán)(脯氨酸蘇氨酸)(1)，環(huán)(脯氨酸酪氨酸)(2)，1呋喃基1，2乙二醇(3)，(3，4，22)12烯3，22，23三羥基齊墩果烷(4)，甘露醇(5)，尿苷(6)和甘草素(7)。以上化合物均為首次從該真菌中分離得到

2、。用濾紙片瓊脂擴散法測定上述化合物的抗菌活性，其中化合物1、2和7具有明顯抗金葡菌和耐甲氧西林金葡菌活性。 【關鍵詞】鹵蕨； 內(nèi)生真菌； 青霉屬； 環(huán)二肽； 抗菌活性ABSTRACT To study the antibacterial constituents from the fermentation broth of endophytic fungus Penicillium sp. 0935030 from mangrove plant Acrostichum aureurm. The separation procedure was guided by antibacterial b

3、ioassay. Seven compounds were isolated and purified by column chromatography, and their structures were identified as cyclo (ProThr) (1), cyclo (ProTyr) (2), 1(2Furanyl)1,2ethanediol (3), (3,4,22)olean12ene3,22,23triol (4), mannitol (5), uridine (6), and liquiritigenin (7) by physicochemical and spe

4、ctral data. All compounds were isolated from this fungus for the first time. Antibacterial activities of all the compounds were assayed by paper disk diffusion method, and compounds 1, 2, and 7 showed inhibitory effect on Staphylococcus aureus and methicillinresistant Staphylococcus aureus.KEY WORDS

5、 Acrostichum aureurm; Endophytic fungus; Penicillium Thom; Cyclic dipeptide; Antibacterial activity紅樹林(mangrove)是生長在熱帶和亞熱帶潮間帶的一種特殊的常綠植物群落，它包括了陸地和水體兩個生態(tài)系統(tǒng)1。紅樹植物及其內(nèi)生真菌為適應這一特殊生境，其生理特性和代謝途徑有其自身的特性，并產(chǎn)生出多種類型的次生代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已成為尋找生物活性成分的重要資源2。自1961年Jevons3發(fā)現(xiàn)了第一株耐甲氧西林金葡菌(methicillinresistant Staphylococcus aureus，M

6、RSA)，至今MRSA已成為全球 醫(yī)院 感染的重要病原菌之一。MRSA具有廣譜耐藥性，其所致感染的 治療 是臨床十分棘手的難題，尋找有效治療MRSA的新抗生素已經(jīng)成為當今醫(yī)藥界的重要任務4。本研究組在對紅樹植物共附生微生物的培養(yǎng)物進行生物活性篩選過程中， 發(fā)現(xiàn)紅樹林植物鹵蕨(Acrostichum aureurm)內(nèi)生真菌Penicillium sp.0935030的發(fā)酵液顯示出抗MRSA活性。為了尋找其中的抗菌活性成分，以MRSA、金葡菌和白念珠菌為模型，在活性篩選指導下，從該發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離得到7個化合物，經(jīng)MS、NMR、1H1H COSY、HMQC和HMBC等鑒定其結(jié)構(gòu)分別為

7、：環(huán)(脯氨酸蘇氨酸)(1)、環(huán)(脯氨酸酪氨酸)(2)、1呋喃基1，2乙二醇(3)、(3，4，22)12烯3，22，23三羥基齊墩果烷(4)、甘露醇(5)、尿苷(6)和甘草素(7)。以上化合物均為首次從該真菌中分離得到，其中化合物1、2和7具有明顯抗MRSA和金葡菌的活性(Fig.1)。1 材料與方法 1.1 試驗試劑和儀器熔點用北京泰克儀器有限公司生產(chǎn)的X5型顯微熔點儀測定(未校正)。旋光在JASCO20C數(shù)字旋光儀上測定；MS用VG Autospec3000型質(zhì)譜儀測定；NMR用Bruker av400超導核磁儀測定，以TMS為內(nèi)標；薄層層析硅膠和柱層析硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品；Sepha

8、dex LH20為Merck公司產(chǎn)品；GJ100BE發(fā)酵罐(江蘇鎮(zhèn)江生物儀器公司)；硫酸卡那霉素(上海生工有限公司)，氟康唑(貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號A05031404)，其它試劑均為分析純。供試菌株MRSA ATCC9551由英國Heriot Watt大學Burgess博士提供；金葡菌(Staphylococcus aureus)ATCC51650和白念珠菌(Candida albicans)ATCC10231購于海南省藥品檢驗所。MRSA和金葡菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基5：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，定容至1L，pH7.07.2，121滅菌20min；白念珠菌采用

9、YPD培養(yǎng)基6：葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，酵母粉10g，瓊脂20g，定容至1L，pH7.0，121滅菌20min。1.2 菌株的分離與培養(yǎng)(1)菌株 菌株093503分離自海南文昌清瀾港紅樹林植物鹵蕨(Acrostichum aureurm)的根，植物樣品由 中國 熱帶農(nóng)業(yè) 科學 院熱帶生物技術研究所代正福副研究員鑒定為鹵蕨，菌株093503由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所洪葵教授研究組鑒定為青霉屬，初篩具有抗MRSA活性。菌種保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所。(2)培養(yǎng)改良Martin培養(yǎng)基5 葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO47H2O 0.5g，瓊脂

10、20g，50%陳海水定容至1L，pH7.2，121滅菌30min。黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)基7 可溶性淀粉20g，蛋白胨2g，酵母粉5g，黃豆粉15g，NaCl 4g，CaCO3 4g，50%陳海水定容至1L，pH7.27.4，121滅菌25min。青霉093503經(jīng)Martin培養(yǎng)基平板活化，接種于黃豆粉種子培養(yǎng)基中，28，180r/min振蕩培養(yǎng)3d，按1%接種量接種到70L黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵罐28培養(yǎng)7d。發(fā)酵2批，發(fā)酵液共140L。1.3 活性測試(1)生物活性測試方法8 將樣品配成濃度為10mg/ml的溶液，加樣品溶液50l于直徑6mm的滅菌濾紙圓片上，待溶劑揮干后，將已點樣的濾紙圓片貼于

11、已涂供試菌懸液100l(菌液濃度105107cfu/ml)的瓊脂培養(yǎng)基上，放置20min，再放入培養(yǎng)箱中37無光照培養(yǎng)，24h后測其抑菌圈大小，每個樣品做三個重復。金葡菌和MRSA以硫酸卡那霉素，白念珠菌以氟康唑作為陽性對照。(2)有效組分提取液的確定 取菌株093503的菌絲體1.0g，用甲醇浸提2次得到提取物A。同時取發(fā)酵液100ml，減壓濃縮蒸干后得到提取物B。提取物A和B的活性測試結(jié)果表明，提取物B顯示出抗菌活性。將發(fā)酵液的提取物配成5mg/ml的蒸餾水混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取并測試活性。結(jié)果表明乙酸乙酯萃取物具有與粗提物相應的生物活性，故確定乙酸乙酯提取物為活性提取

12、物。1.4 提取與分離青霉093503發(fā)酵液140L經(jīng)紗布過濾得菌絲體和發(fā)酵上清液。將發(fā)酵上清液于45減壓濃縮至5L，依次用低沸點石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，減壓濃縮分別得到石油醚浸膏(1.2g)、乙酸乙酯浸膏(17.0g)和正丁醇浸膏(25.0g)。乙酸乙酯浸膏(17.0g)經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚丙酮梯度洗脫得到10個流份(Fr.110)，每個組分經(jīng)上述活性測試方法進行活性測試，確定組分Fr8和Fr10為活性組分。活性組分再經(jīng)反復硅膠柱色譜、Sephadex LH20柱色譜，分別得到化合物1(10.5mg)，化合物2(20.9mg)，化合物3(14.7mg)，化合物4(38.3mg)，化合

13、物5(303.5mg)，化合物6(5.0mg)和化合物7(6.7mg)。2 結(jié)果與討論 2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定化合物1 白色粉末，體積分數(shù)10%的硫酸顯紅色，18D=-115(c 0.3，MeOH)。在正離子FABMS中，出現(xiàn)準分子離子峰199M+1+(基峰)，結(jié)合13CNMR(DEPT)譜，確定其分子式為C9H14N2O3。1HNMR(400MHz，CD3OD)：4.29(1H，m，HThr)，4.20(1H，m，HThr)，3.97(1H，m，HPro)，3.55(1H，m，HPro)，3.48(1H，m，HPro)，2.30(1H，m，HPro)，1.99(2H，m，HPro)，1.8

14、7(1H，m，HPro)，1.33(3H，d，J=6.5Hz，HThr)；13CNMR(100MHz，CD3OD)：172.0(CO)，167.0(CO)，67.0(CThr)，61.3(CThr)，60.2(CPro)，46.2(CPro)，29.5(CPro)，23.3(CPro)，20.3(CThr)。與 文獻 9對照數(shù)據(jù)基本一致，因此確定化合物1為環(huán)(脯氨酸蘇氨酸)。化合物2 白色粉末，體積分數(shù)10%的硫酸顯紅色，18D=(145(c 1.0，H2O)。紅外光譜IRKBrmax：3418，1704，1600，1513，1444，1370cm-1。在正離子FABMS中，出現(xiàn)準分子離子峰2

15、61M+1+(基峰)，結(jié)合13CNMR(DEPT)譜，確定其分子式為C14H16N2O3。1HNMR(400MHz，CD3OD)：7.04(2H，d，J=8.4Hz，2，6HTyr)，6.70(2H，d，J=8.4Hz，3，5HTyr)，4.35(1H，t，J=6.2Hz，HTyr)，4.03(1H，dd，J=6.2，10.0Hz，HPro)，3.513.56(1H，m，HPro)，3.303.36(1H，m，HPro)，3.05(2H，dd，J=5.2，9.2Hz，HTyr)，2.062.10(1H，m，HPro)，1.781.80(2H，m，HPro)，1.191.23(1H，m，HPro

16、)；13CNMR(100MHz，CD3OD)：170.8(CO)，167.0(CO)，157.9(C4)，132.1(C2，6)，127.7(C1)，116.2(C3，5)，60.1(CPro)，57.9(CTyr)，45.9(CPro)，37.7(CTyr)，29.4(CPro)，22.8(CPro)。與 文獻 10氫譜數(shù)據(jù)一致，因此確定化合物2為環(huán)(脯氨酸酪氨酸)。化合物3 黃色油狀，體積分數(shù)10%的硫酸顯藍黑色。18D=+33.5(c 2.4，CHCl3)，EIMSm/z：128M+，110，97，81，69，53，40；1HNMR(400MHz，CD3OD)：7.44(1H，m，5H)

17、，6.316.36(2H，m，3，4H)，4.67(1H，t，J=5.6Hz，2H)，3.76(2H，d，J=5.6Hz，1a，1bH)；13CNMR(100MHz，CD3OD):156.3(C2)，111.2(C3)，143.2(C4)，107.7(C5)，65.8(C1)，69.6(C2)?；衔?的1HNMR與文獻11的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物3為1呋喃基1，2乙二醇?；衔? 無色結(jié)晶(甲醇)，體積分數(shù)10%的硫酸顯紅色。EIMS m/z：458M+(100)。1HNMR(400MHz，acetoned6)：0.88(3H，s)，0.89(3H，s)，0.94(3H，s)，0.98(3

18、H，s)，1.05(3H，s)，1.15(3H，s)，1.20(3H，s)，5.24(1H，t，J=3.6Hz，12H)；13CNMR(100MHz，acetoned6)：39.3(C1)，28.0(C2)，80.7(C3)，43.4(C4)，56.7(C5)，19.3(C6)，33.9(C7)，40.5(C8)，48.6(C9)，37.5(C10)，24.4(C11)，122.9(C12)，145.4(C13)，42.3(C14)，26.7(C15)，28.3(C16)，38.1(C17)，45.9(C18)，47.3(C19)，31.1(C20)，42.8(C21)，76.1(C22)，2

19、3.2(C23)，64.7(C24)，16.5(C25)，17.3(C26)，25.7(C27)，28.5(C28)，33.2(C29)，21.2(C30)?；衔?的13CNMR數(shù)據(jù)與文獻12基本一致，確定化合物4為(3，4，22)12烯3，22，23三羥基齊墩果烷?；衔? 無色針狀結(jié)晶(甲醇)，體積分數(shù)10%的硫酸不顯色，高錳酸鉀顯黃色，mp 166168。負離子ESIMS顯示準分子離子峰為m/z：181MH-。1HNMR(400MHz，DMSOd6)：4.39(2H，d，J=5.2Hz)，4.31(2H，t，J=5.1Hz)，4.12(2H，d，J=7.0Hz)，3.61(2H，m)，

20、3.55(2H，t，J=7.4Hz)，3.45(2H，m)，3.38(2H，m)；13CNMR(100MHz，DMSOd6)：71.3，69.8，63.8。從化合物3的13CNMR數(shù)據(jù)可知該化合物有一定的對稱性，其特征與甘露醇的譜圖特征一致；其1HNMR數(shù)據(jù)與文獻13的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物5為甘露醇?；衔? 白色粉末(甲醇)，體積分數(shù)10%的硫酸顯紅色，ESIMSm/z：252M+Li+，156。1HNMR(400MHz，CD3OD)：8.01(1H，d，J=8.0Hz，6H)，5.93(1H，d，J=4.5Hz，1H)，5.91(1H，d，J=8.0Hz，5H)；13CNMR(100M

21、Hz，CD3OD)：152.5(C2)，166.2(C4)，102.7(C5)，142.8(C6)，90.8(C1)，75.8(C2)，71.4(C3)，86.4(C4)，62.3(C5)。與文獻14報道的尿苷數(shù)據(jù)相符，確定化合物6為尿苷。化合物7 黃色固體，體積分數(shù)10%的硫酸顯淡黃色，mp 200202，18D=(35.5(c 2.4，MeOH)。1HNMR(400MHz，CDCl3)：7.72(1H，d，J=8.8Hz，5H)，7.31(2H，d，J=8.4Hz，2，6H)，6.82(2H，d，J=8.4Hz，3，5H)，6.49(1H，dd，J=8.8，2.4Hz，6H)，6.36(1

22、H，d，J=2.0Hz，8H)，5.36(1H，dd，J=13.2，2.8Hz，2H)，3.04(1H，dd，J=16.8，13.2Hz，3H)，2.70(1H，dd，J=16.8，2.8Hz，3H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)：78.9(C2)，42.9(C3)，191.5(C4)，127.8(C5)，109.8(C6)，164.6(C7)，101.8(C8)，163.4(C9)，112.9(C10)，129.2(C1)，126.9(C2)，114.4(C3)，156.8(C4)，114.4(C5)，126.9(C6)?；衔?的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)與文獻15基本一致，

23、確定化合物7為甘草素。2.2 抗菌活性采用濾紙片瓊脂擴散法測定化合物的抗菌活性(表1)，結(jié)果表明化合物1、2和7對MRSA和金葡菌有明顯抑制作用，對白念珠菌則沒有表現(xiàn)出活性。其余化合物均沒有表現(xiàn)出對MRSA、金葡菌和白念珠菌的活性。表1 化合物1、2和7對兩種病源菌的抑菌圈直徑許多天然環(huán)二肽化合物都具有明確的生物活性，例如作為抗生素，苦味劑，植物生長抑制劑以及激素釋放抑制劑等16。在已發(fā)現(xiàn)的天然環(huán)二肽中，Thr出現(xiàn)頻率很低，環(huán)(ProThr)作為苦味劑被研究過；環(huán)(ProTyr)在細菌、真菌中均有發(fā)現(xiàn)，具有誘導生物發(fā)光和色素產(chǎn)生的活性17。本研究首次報道環(huán)(ProThr)和環(huán)(ProTyr)對MRSA和金葡菌具有抑制活性，因此，對于環(huán)二肽類化合物的生物活性有待于進一步深入研究。文獻報道甘草素有抗菌和解痙作用，能抑制單胺氧化酶，可 治療 精神抑郁病18，本次研究發(fā)現(xiàn)甘草素對MRSA和金葡菌亦顯示出抑制活性。【 參考 文獻】 1 林鵬.中國 紅樹林研究進展 J. 廈門大學學報( 自然科學 版)，2001，40(2)：592603.2 林永成. 海洋微生物及其代謝產(chǎn)物M. 北京：化學 工業(yè) 出版社，20