三羥基異黃酮抑制乳腺癌細胞生長的質(zhì)譜研究

1、三羥基異黃酮抑制乳腺癌細胞生長的質(zhì)譜研究         11-01-07 13:18:00     編輯：studa20                作者：阮禹松，萬明習，李曉華【摘要】  目的 初步研究低濃度的三羥異黃酮對人乳腺癌細胞系MCF7的生長抑制作用，并通過蛋白質(zhì)組學方法探討其分子機制。方法 MCF7細胞

2、在含25mol/L三羥異黃酮的培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)17d后，進行MTT實驗，測得生長曲線;采用順序抽提的方法將細胞總蛋白分級為水溶性和疏水性兩個組分，并應(yīng)用雙向電泳方法對其進行分離，以獲取蛋白質(zhì)的表達譜;通過軟件分析，找出表達量存在顯著差異的蛋白質(zhì)點;再應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDITOFMS)與生物信息學相結(jié)合的方法對差異表達蛋白點進行分析鑒定。結(jié)果 25mol/L的三羥異黃酮對MCF7細胞具有明顯的抑制作用，并在4d后觀察到細胞凋亡現(xiàn)象的出現(xiàn);雙向電泳圖譜分析表明無論是水溶性蛋白質(zhì)還是疏水性蛋白都取得了很好的分離，并成功鑒定出24種差異表達蛋白，其中5種下調(diào)，19種上調(diào)。結(jié)論

3、 這些蛋白質(zhì)的功能涉及了細胞的生長調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)、形態(tài)和凋亡等多個方面。 【關(guān)鍵詞】  乳腺癌;蛋白質(zhì)組學;順序抽提;雙向電泳;基質(zhì)輔助激光解吸離子化電離飛行時間質(zhì)譜;三羥基異黃酮ABSTRACT: Objective To investigate the inhibitory effects of low concentration of genistein on human breast cancer cell line MCF7 and explore its molecular mechanism using proteomic technologies. Methods L

4、og phase cells were cultured in 96well plates at a density of 1×103 cells/well with 25mol/L genistein for 1 to 7 days respectively to obtain growth curve by MTT assay. Sequential protein extraction was used and proteins were fractionated as soluble or hydrophobic fractions which were then analy

5、zed by 2DE. Spots were detected and evaluated by 2D platinum Software 5.0 and the spots with different expression level were subjected to MS analysis. Results Genistein of 25mol/L obviously inhibited the growth of MCF7 cells and could induce apoptosis of the cells after 4 days cultivation; 2DE patte

6、rns demonstrated a good resolution either for soluble proteins or for hydrophobic proteins. Moreover, 24 significant proteins were identified, among which 19 were upregulated and 5 were downregulated. Conclusion These proteins functions are involved in many aspects of cell physiological functions su

7、ch as growth regulation, stress response, cell morphogenesis and apoptosis.KEY WORDS: breast cancer; proteomics; sequential extraction; twodimensional electrophoresis(2DE); matrixassisted laser desorption/ ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS); genistein目前有許多學者對三羥基異黃酮的抑癌作用進行了大量的研究，其

8、作用機制涉及了雌激素受體調(diào)節(jié)作用、抑制類胰島素生長因子、酪氨酸蛋白激酶以及拓撲異構(gòu)酶II活性等多個方面14。由于三羥基異黃酮與雌二醇分子結(jié)構(gòu)存在很大的相似性，以往常將其抗癌能力歸結(jié)為性激素調(diào)節(jié)作用。然而大量地體外實驗表明高濃度(50mol/L)的三羥基異黃酮對依賴雌激素的乳腺癌細胞系和不依賴雌激素的乳腺癌細胞系都表現(xiàn)出生長抑制效應(yīng)5，而且三羥基異黃酮還是表皮生長因子受體的一個強有力的抑制劑(其半抑制濃度為2.6mol/L)。然而三羥基異黃酮并不阻礙DU145前列腺癌細胞系EGFR的磷酸化及活化6，這一點也在其他的癌細胞系中得到了證實。此外，極低濃度(1nmol/L10mol/L)的三羥基異黃酮

9、還能刺激MCF7細胞(雌激素受體陽性)生長，但對MDAMB435乳腺癌(雌激素受體陰性)細胞系卻無此效應(yīng)7。這些研究結(jié)均果提示三羥基異黃酮的抗癌效應(yīng)有其他途徑的存在。以往的研究方法(如免疫沉淀法)往往只考慮到一個或少數(shù)幾個蛋白或mRNA的變化，不可避免地存在一定的局限性和片面性。事實上任何生理、病理變化或藥物影響的結(jié)果都與蛋白質(zhì)的組成和量的改變密切相關(guān)。因此，只有對蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量進行整體、全面、動態(tài)的考察(即蛋白質(zhì)表達譜)，才能更準確、靈敏地反映出腫瘤的性狀和生物學行為。所以，本文試圖通過對三羥基異黃酮作用下的MCF7細胞蛋白質(zhì)表達譜的分析，以闡明三羥基異黃酮的作用機制。1 材料與方法1.

10、1 試劑 三羥基異黃酮(genistein)、曲拉酮(Triton X100)、碘乙酰胺(iodoacetamide, IAA)、胰酶(TPCKtrypsin)、尿素(urea)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、氰基242羥基肉桂酸(CHCA)均購自Sigma(Taufkirchen, Germany)公司;丙烯酰胺單體、甘氨酸、礦物油、IPG膠條(pH 310, 47以及611)、低分子量標準、IPG buffer (pH 310，47以及611)和Protease Inhibitor Mix均購自Amersham Pharmacia Biotech公司(Uppsala

11、, Sweden);二甲基亞砜(DMSO)、三氟乙酸、Tris堿、乙醇、乙腈以及三丁基磷(tributyl phosphine TBP，體積分數(shù)85%)購自Fluka(Buchs, switzerland);Dulbeccos modified eagle medium (DMEM)培養(yǎng)液、小牛血清、牛胰島素、磷酸鹽緩沖液購自Hyclone(Utah, America)。所有溶液均用超純水(來自MilliQ)配制。1.2 主要儀器和設(shè)備 IPGphor 等電聚焦儀(GE公司);UP 200S超聲破碎儀(Dr. Hielscher GmbH);Ult rospec 2100proUV(Amers

12、ham Bioscience);Hoefor SE600垂直電泳儀(Amersham Biosciences);ScanMaker 8700掃描儀(MICROTEC);Model 250 pH計(Thermo Orion);Milli Q超純水發(fā)生器(Millipore);VoyagerDETM MALDITOF質(zhì)譜儀(Applied Biosystems);CentriVap Concentrator(Labconco公司);凝膠圖像分析軟件ImageMaster 5.0(Amersham Biosciences公司);超速低溫離心機3K30(德國Sigma公司);CO2細胞培養(yǎng)箱(REVC

13、O2 EL ITE22);倒置顯微鏡IX70(Olympus);BP800(BIOHIT)酶標儀。1.3 方法將水溶性蛋白組分和洗脫后的膜樣品用裂解液(7mol/L urea，2mol/L thiourea，40g/L CHAPS，5mL/L Triton X100，10mL/L IPG buffer，5mmol/L TBP，10mL/L Protease Inhibitor Mix和20mmol/L Tris)溶解，4震蕩1h后，20000×g離心1h，將上清(上清吸取時要小心避開液體表面的脂質(zhì)層)轉(zhuǎn)移到另一個離心管中。定量，60g分裝，保存于-80。Pharmacia, Swed

14、en)軟件進行分析。點檢測參數(shù)設(shè)置如下：首先，將Smooth parameter調(diào)整為2.5使得所有真正的點均可被檢測，然后，將minimum area設(shè)置為10 pixels 以消除面積小于該值的點。最后，根據(jù)實際情況調(diào)整saliency parameter參數(shù)以消除假點(本實驗中該值為1)。保留這些參數(shù)用于所有本實驗中需要比較的2DE凝膠圖。為了更能準確地反映實驗和對照組在蛋白質(zhì)表達量上的差異，我們將其各自3次重復的膠組合成平均膠，再相互比較計算對應(yīng)蛋白質(zhì)點之間量的關(guān)系。2 結(jié) 果2.1 三羥基異黃酮的生長抑制作用 為了探究低濃度的異黃酮對MCF7細胞是否具有生長抑制作用，我們用含25mol/L異黃酮的培養(yǎng)液將MCF7細胞在96孔板里培養(yǎng)07d，分別進行MTT分析(圖1)。結(jié)果表明從加入異黃酮后的第2天開始，25mol/L的異黃酮對MCF7就具有明顯的生長抑制作用。其抑制效果可達正常生長的50%左右。另一方面，我們將對數(shù)生長期的MCF7細進行了同樣濃度的培養(yǎng)以觀