雷公藤內(nèi)酯醇對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞IL18及其受體表達(dá)的影響

1、雷公藤內(nèi)酯醇對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞IL18及其受體表達(dá)的影響         11-01-28 13:18:00     編輯：studa20                     作者：毛曉丹, 孫賽君, 裴紫燕, 張立煌【摘要】  目的: 研究雷公藤內(nèi)酯醇(

2、TP)對佛波酯(PMA)刺激的關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞(RASF) 白細(xì)胞介素18(IL18)及其受體（IL18R）表達(dá)的影響, 并對其機(jī)制進(jìn)行探討。方法: RASF先用TP(0100 g/L) 預(yù)處理2 h, 再用PMA (50 g/L)刺激。收集上清用 ELISA 法檢測上清IL18水平。利用人IL18能特異誘導(dǎo)人髓系單核細(xì)胞KG1產(chǎn)生IFN的特性檢測上清中IL18生物學(xué)活性。收集處理的RASF, 用Western blot 和熒光定量RTPCR檢測IL18和IL18R的蛋白和mRNA表達(dá)。NFB的活性用類ELISA法檢測。 結(jié)果: TP能有效抑制PMA刺激的RASF的IL18生物學(xué)活性。TP能

3、夠抑制PMA刺激的RASF的IL18和IL18R的蛋白和mRNA表達(dá)。TP還抑制PMA刺激的RASF 的NFB 活性。TP對PMA刺激的RASF 的抑制效應(yīng)呈劑量相關(guān)性。結(jié)論: TP能有效抑制PMA刺激的RASF 的IL18和IL18R的表達(dá)。這些結(jié)果說明了TP對RA治療作用的機(jī)制。 【關(guān)鍵詞】  雷公藤內(nèi)酯醇; 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎; IL18; IL18R    Abstract  AIM:  To determine the effects of triptolide (TP) on the expression of interleu

4、kin18 (IL18) and its receptor in phorbol 12myristate 13acetate (PMA)stimulated rheumatoid arthritis synovial fibroblasts (RASF). METHODS:   RASF were pretreated with TP (0-100 g/L) for 2 h before stimulation with PMA (50 g/L). The bioactivity of IL18 in the supernatant was detected based o

5、n IFN secretion from IL18responding human myelomonocytic KG1 cells. IL18 level was analyzed by ELISA. To estimate the protein and mRNA expression of IL18 and IL18R in RASF,  Western blot and quantitative RTPCR were performed. Nuclear factorB (NFB) activity in the wholecell extract of treated RA

6、SF was also measured using an ELISAbased method. RESULTS:   TP effectively inhibited the bioactivity of IL18 in PMAstimulated RASF. The expression of IL18 and IL18R at protein and gene levels was reduced by TP. NFB activity in PMAstimulated RASF was profoundly suppressed by TP. These effec

7、ts showed a high correlation with TP concentration (0-100 g/L). CONCLUSION:  TP effectively inhibited the expression of IL18 and its receptor in PMAstimulated RASF. These results suggest a mechanism of TP in RA therapy.    Keywordstriptolide;  rheumatoid arthritis;  int

8、erleukin18;  interleukin18 receptor類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一個自身免疫性疾病, 主要表現(xiàn)為滑膜成纖維細(xì)胞的大量增生和炎性細(xì)胞浸潤的多關(guān)節(jié)滑膜組織的慢性炎癥。RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織過度表達(dá)IL18、 TNF、 IL1等炎癥細(xì)胞因子1, 進(jìn)而激活關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞NFkB的活性, 促進(jìn)COX2、 iNOS的大量表達(dá), 迅速大量合成PGE2、 NO, 導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜炎癥、 腫脹、 增生、 滑膜血管翳大量生成, 最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)退變, 此為RA重要的發(fā)病機(jī)制之一2。IL18在RA發(fā)生發(fā)展中起到重要作用3, 下調(diào)IL18的活

9、性是治療RA的一個潛在策略。    雷公藤為中國傳統(tǒng)中藥, 具有明顯的抗炎、 抗風(fēng)濕及免疫抑制作用4。雷公藤內(nèi)酯醇（Triptolide, TP）是中藥雷公藤的有效單體成分5, 其抗RA機(jī)制主要為抑制機(jī)體的免疫反應(yīng), 下調(diào)Th1類細(xì)胞及細(xì)胞因子的活性, 進(jìn)而抑制炎癥因子及炎癥介質(zhì)的表達(dá)。隨著細(xì)胞及分子生物學(xué)研究的深入, TP抗炎及抗RA的分子機(jī)制也得到進(jìn)一步的認(rèn)識。我們研究TP對PMA刺激的RASF IL18及其受體（IL18R）表達(dá)的影響, 并對其機(jī)制進(jìn)行探討, 為TP抗RA治療提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。    1  材料和

10、方法    1.1  類風(fēng)濕關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞（RASF）的分離和培養(yǎng)  關(guān)節(jié)滑膜組織取材于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科, 行膝關(guān)節(jié)置換或滑膜切除術(shù)的5例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者, 均符合1987年美國風(fēng)濕病協(xié)會修訂的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。無菌條件下剪碎滑膜組織, 用含4.0 g/L膠原酶（Sigma）的RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco）, 于37、  50 mL/L CO2培養(yǎng)箱孵育消化4 h, 離心收集細(xì)胞, 加含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液, 于37、 50 mL/L CO2孵育箱中培養(yǎng), 使細(xì)胞貼壁。棄除未貼壁的

11、細(xì)胞, 繼續(xù)培養(yǎng)18 h, 貼壁細(xì)胞用DHanks徹底沖洗后, 用含2.5 g/L胰酶的消化液（Gibco）消化收集貼壁的滑膜成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)。經(jīng)34次傳代后, 用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞純度達(dá)98%以上CD3、 CD20、 CD68、 Von Willibrand factor (第8因子相關(guān)抗原)陽性細(xì)胞1%。    1.2  實(shí)驗(yàn)分組及滑膜成纖維細(xì)胞的處理  將滑膜成纖維細(xì)胞1×106/孔接種于6孔板（Falcon）中, 待細(xì)胞完全貼壁后棄上清, 用含不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇（TP, 0100 g/L）的培養(yǎng)液預(yù)處理2 h, 然后加佛波

12、酯（PMA, 50 g/L, Sigma）刺激, 繼續(xù)培養(yǎng)18 h。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液及細(xì)胞, 備檢。    1.3  IL18的生物活性檢測  利用人IL18能特異誘導(dǎo)人髓系單核細(xì)胞KG1（引自美國ATCC, CCL246, 由本所常規(guī)傳代保存）產(chǎn)生IFN的特性, 通過ELISA法檢測培養(yǎng)上清液IFN的水平（hIFN ELISA Kit, 美國R&D Systems）, 結(jié)果以IFN濃度反映被測樣品中IL18的生物活性。按Yamamura等6方法操作。所有檢測樣品均用鼠抗人IL18單克隆抗體（D0443, 美國R&D Sy

13、stems）中和后作對照（抗體終濃度2 mg/L, 37作用1 h）, 以示其特異性。    1.4  雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測  采用ELISA法, 檢測培養(yǎng)上清液IL18（hIL18 ELISA Kit,  MBL Japan）的水平。操作嚴(yán)格按說明進(jìn)行。最后于全自動酶標(biāo)儀（BioTek Elx800, 美國）讀取A450值, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)曲線求得樣品IL18的水平。    1.5  細(xì)胞蛋白提取及Western blot檢測  收集細(xì)胞, 加細(xì)胞裂解液Lysi

14、s Buffer,  20 mmol/L TrisHCl (pH7.5),  150 mmol/L NaCl,  1 mmol/L Na2EDTA,  1 mmol/L EGTA,  10 mL/L Triton,  10 mL/L NP40,  2.5 mmol/L Sodium pyrophosphate,  1 mmol/L glycerophosphate,  1 mmol/L  Leupeptin,  1 mmol/L PMSF, 冰浴30 min后于10 000 r/min

15、離心3 min, 收集離心上清液, 于蛋白分析儀（Beckman DU640）上測定各樣品蛋白含量（Bradford比色法, 美國Pierce公司）。取40  g蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性后, 進(jìn)行100 g/L SDSPAGE, 并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（0.45 m, ImmobilonP, Millipore）, 于封閉液（含50 g/L脫脂奶粉, 20 g/L BSA, 0.5 mL/L Tween20的PBS）室溫封閉2 h, 分別加入抗人IL18、 抗人IL18R（1500,  R&D System）或抗人Actin抗體（12 000,  San

16、ta Cruz）, 于雜交爐（Hybaid）中室溫滾動反應(yīng)2 h; 洗膜5 min×3次, 加相應(yīng)的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗(15 000,  Santa Cruz), 室溫反應(yīng)2 h; 充分洗膜后作ECL化學(xué)發(fā)光（SuperSignal West Dura Kit,  Pierce）, X片（Kodak）曝光顯影。    1.6  熒光定量RTPCR檢測  收集各組滑膜細(xì)胞, 用TRIzol（美國Gibco公司）常規(guī)提取總RNA, 溶于50 L DEPC處理水, 經(jīng)核酸蛋白紫外分析儀（Beckman D

17、U640）檢測, 260/280比值為1.751.80。取1 g總RNA于42逆轉(zhuǎn)錄（SuperScript II Reverse Transcriptase, Invitrogen）50 min后, 以肌動蛋白（actin）作為內(nèi)對照, 進(jìn)行熒光定量PCR（LightCycler FastStart SYBR Green I Master, Roche）檢測IL18及IL18R mRNA表達(dá)水平。IL18引物（擴(kuò)增產(chǎn)物480 bp）上游: 5TTC GGG AAG AGG AAA GGA AC3, 下游: 5AAG GAT ACA AAA AGT GAC AT3; IL18R引物（擴(kuò)增產(chǎn)物4

18、19 bp）上游: 5CCC AAC GAT AAA GAA GAA CGC C3, 下游: 5TGT CTG TGC CTC CCG TGC TGG C3; actin引物（擴(kuò)增產(chǎn)物619 bp）上游: 5CGC TGC GCT GGT CGT CGA CA3, 下游: 5GTC ACG CAC GAT TTC CCG CT3。每個LightCycler PCR（15 L）反應(yīng)體系為: 1.5 L LightCycler FastStart DNA Master Mix, 1.8 L MgCl2（25 mmol/L）, 0.4 L of each primer（10 mol/L）, 2 L經(jīng)10倍稀釋的cDNA, 9.3 L H2O。PCR程序?yàn)?5預(yù)變性10 min; 94變性10 s, 65復(fù)性15 s, 72延伸15 s, 擴(kuò)增50個循環(huán); PCR產(chǎn)物95變性1 min后迅速降溫至55維持30 s, 緩慢升溫（0.1  steps）至95, 收集熒光信號, 熔解曲線分析。結(jié)果以目的基因與相應(yīng)的actin比值表示。反應(yīng)結(jié)束后, 取5 L PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠（15 g/L）電泳檢測。    1.7  NFB p65活性檢測  用NFB p65轉(zhuǎn)錄因子試劑盒(Acti