酶法合成7-ACA及頭孢菌素類抗生素的研究進展-

1、酶法合成7-ACA 及頭孢菌素類抗生素的研究進展芮菊1 張體磊2山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司,山東濟寧272100摘要 頭孢菌素類抗生素在制藥工業(yè)中占據(jù)重要的地位,相關(guān)產(chǎn)品的酶法合成備受關(guān)注;酶法合成-內(nèi)酰胺類抗生素顯著提高了合成效率,減少了三廢排放。綜述了近年來酶法合成7-氨基頭孢烷酸(7-ACA 、頭孢唑林、頭孢氨芐、頭孢拉定的合成方法。關(guān)鍵詞 頭孢菌素;酶法合成;7-ACAProgress in enzymatic synthesis of 7-ACA and cephalosporinsRui Ju 1 Zhang Ti-Lei 2Abstract Cephalosporins antib

2、iotics played an important role in pharmaceutical industry. Enzymaticsynthesis -lactam antibiotics could decline the generation of waste and the cost of production remarkably. This review focuses on the recent progresses of enzymatic semi -synthesis of 7-ACA 、cefazolin 、c efalexinandcefradine.Keywor

3、ds cephalosporin; enzymatic synthesis; 7-ACA酶法合成技術(shù)始于20 世紀60 年代末70 年代初, 經(jīng)過30 多年的發(fā)展,目前酶縮合反應(yīng)技術(shù)、產(chǎn)品分離以及固定化酶技術(shù)等方面取得很大的發(fā)展, 配套技術(shù)日益完善, 具備了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的條件, 全球著名的-內(nèi)酰胺抗生素生產(chǎn)廠家如荷蘭DSM 公司已有酶法合成的商品頭孢氨芐、阿莫西林等產(chǎn)品面世。我國酶法合成研究起步并不晚, 目前已有大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn), 與國外先進廠家差距較大。隨著我國經(jīng)濟快速發(fā)展, 人們對自身居住環(huán)境的要求, 政府對環(huán)保的重視, 酶法合成將是發(fā)展的必然趨勢。 7-氨基頭孢烷酸(7-ACA 是生

4、產(chǎn)頭孢菌素類抗生素的重要母核,頭孢菌素分子中由于都含有-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)(圖1。它能抑制肽轉(zhuǎn)肽酶所催化的轉(zhuǎn)肽反應(yīng),使線性高聚物不能交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),抑制粘肽的臺成,從而阻止細胞壁的形成,導(dǎo)致細胞的死亡。N S O RCONHRCOOH CH 2X21345687圖1頭孢茵素的結(jié)構(gòu)7-ACA 和頭孢菌素的合成工藝主要有化學(xué)法和酶法兩種。化學(xué)半合成技術(shù)是目前通用的工藝,主要包括酰氯法和混酐法1,化學(xué)法合成存在著活化、縮合、保護和去保護的過程;合成過程長、步驟多反應(yīng)條件苛刻產(chǎn)生大量的三廢等弊端,而酶法合成工藝與化學(xué)法相比,由于具有許多優(yōu)點,如:生產(chǎn)工藝簡單,周期短;反應(yīng)條件溫和,pH接近中性;高度的區(qū)域和立

5、體選擇性以及無需保護和去保護過程,割除了化學(xué)合成中所需的毒害物質(zhì);勞動環(huán)境得到改善,減少了三廢的排放。因此,用酶法實現(xiàn)7-ACA及頭孢菌素的半合成體現(xiàn)了綠色環(huán)保工藝的各種優(yōu)勢。本文就近年來7-ACA兩步酶法、一步酶法及頭孢菌素抗生素酶法合成的進展進行了綜述1 7-氨基頭孢烷酸(7-ACA的酶法合成7-氨基頭孢烷酸是醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)半合成頭孢菌素的重要中間體,國內(nèi)外在工業(yè)上多采用化學(xué)法由頭孢菌素C鈉(鋅鹽脫去其側(cè)鏈來生產(chǎn)。但化學(xué)法存在工藝復(fù)雜、成本高等問題,而且還會嚴重污染環(huán)境。與化學(xué)法相比,酶法裂解可以使生產(chǎn)過程大大簡化(例如:發(fā)酵得到的頭孢菌素C 不需結(jié)晶就可用于酶解;生產(chǎn)過程中沒有用到有毒溶劑

6、;可省掉加保護劑和去保護劑等步驟 ,產(chǎn)品能夠達到高收率、高質(zhì)量,同時降低成本和減少污染。因此近年來人們著力進行酶法生產(chǎn)7-ACA 的研究。1.1 兩步酶法制備7-ACA目前人們研究較多的是兩步酶法制備7-ACA。首先,頭孢菌素C 在通氧氣情況下被D-氨基酸氧化酶( D-amino acid oxidase ,DAAO 2催化,產(chǎn)生具有酮基的中間體(ketoadipyl 7-aminocephalosporanic acid ,keto-7-ACA 4 O2。這個中間體較不穩(wěn)定,很容易被同時產(chǎn)生的H2O2化學(xué)氧化脫羧,轉(zhuǎn)變成戊二?；?7-氨基頭孢烷酸和H2(glutaryl 7-aminocep

7、halosporanic acid ,GL-7-ACA ,然后GL-7-ACA 在GL-7-ACA 酰化酶(GL-7-ACA acylase 的作用下脫去其側(cè)鏈,生成7-ACA(見圖2。目前國內(nèi)7-ACA大部分的生產(chǎn)廠家,如:山東魯抗、河北石藥、山西威齊達等已將7-ACA的生產(chǎn)線,由化學(xué)法轉(zhuǎn)換為酶法,7-ACA D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA ?；竾鴥?nèi)也有廠家大批量生產(chǎn)。 圖2、頭孢菌素C 經(jīng)兩步酶法轉(zhuǎn)化為7-ACA1.2 一步酶法制備7-ACA雖然兩步酶法制備7-ACA 在生產(chǎn)成本和環(huán)境保護方面有優(yōu)勢,但是從頭孢菌素C 到7-ACA 的轉(zhuǎn)化率與化學(xué)法相比要低,而且DAAO 催化反應(yīng)難以

8、控制。頭孢菌素C ?；D(zhuǎn)移酶(CPC acylase 可以直接把頭孢菌素C 轉(zhuǎn)變到7-ACA (不經(jīng)過GL-7-ACA 等中間產(chǎn)物,因此其轉(zhuǎn)化率與化學(xué)法相當(dāng),而且能得到較高質(zhì)量的7-ACA 。利用CPC acylase 生產(chǎn)7-ACA 的一步酶法(One-step enzymatic process 是非常新的7-ACA 酶法工程,既具有化學(xué)法的優(yōu)勢(高轉(zhuǎn)化率和純度也具有兩步酶法的優(yōu)勢(高經(jīng)濟性和環(huán)境保護,目前韓國已成功開發(fā)出高質(zhì)量的CPC acylase。 CPC acylase2 酶法合成頭孢菌素類抗生素頭孢菌素類藥物是采用7-氨基頭孢烷酸 (7-ACA或7-氨基脫乙酰氧頭孢烷酸(7-AD

9、CA為原料制備得到。其母核上有兩個側(cè)鏈(圖1:C7位置上的酰胺鍵和C3位置上的乙酰氧甲基側(cè)鏈,都可供化學(xué)改造之用。其與適當(dāng)?shù)孽；鶄?cè)鏈連接,便可得到相應(yīng)的半合成頭孢菌素?，F(xiàn)采用化學(xué)法生產(chǎn)的頭孢菌素,大部分都可用酶法合成得到,展示了酶法臺成頭孢菌素類抗生素的廣闊前景3。頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢羥氨芐、頭孢克洛、羥氨唑頭孢菌素、頭孢乙氰、頭孢孟多、頭孢吡硫等均有采用酶法合成的報道。用于合成頭孢菌素類抗生素的酶主要為青霉素酰化酶,其產(chǎn)生菌主要有桿菌及單孢菌,如:巨大芽孢桿菌、無色桿菌、醋酸桿菌、大腸桿菌、粘性節(jié)桿菌、巴氏醋酸桿菌、混濁醋桿菌、假單孢菌、產(chǎn)黑假單孢菌、壞死單孢菌等。a

10、-氨基酸酯水解酶也可用于頭孢菌素的合成,其產(chǎn)生菌主要為單孢菌,如:銅綠假單孢菌、柑桔潰瘍單孢菌。盡管這些產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的酶均能催化相同的反應(yīng),但不同來源的酶,其底物專一性明顯不同,活性中心也不同。下面將介紹一些頭孢菌素抗生素的酶法合成。2.1 “一鍋法”酶法制備頭孢唑林酶法合成-內(nèi)酰胺抗生素, 一般一步反應(yīng)在一個反應(yīng)器中進行, 近年來, 有人將幾步酶法反應(yīng)(例水解縮合或縮合縮合等 在一個反應(yīng)器中進行, 這樣不需分離中間體, 簡化了過程, 有利于工業(yè)化生產(chǎn), 這將是酶法合成的趨勢之一。新型化學(xué)酶法合成頭孢唑林, 通過D-氨基酸氧化酶、戊二?；负颓嗝顾谿 ?；复呋饔? 生物轉(zhuǎn)化頭孢唑林。以頭孢

11、菌素C 為起始原料, 在水溶性中, 經(jīng)三步酶法和一步化學(xué)法合成頭孢唑林, 不分離純化中間體, 每步酶法收率接近100%。先將頭孢菌素C 酶法脫乙?；? 然后由DAAO 和GA 催化, 再由PGA 固定化酶進一步催化?；?-ACA ,得到7- (1H-四氮唑 -乙酰氨基-3-乙酰氧甲基3-頭孢烷酸, 最后與MMTD 側(cè)鏈化學(xué)法縮合得到頭孢唑林。(圖3N NN OOM e+NSO OA cNH2COOHTMG7-ACAPGAN NN ONSO OAcHNCO OHCefazolin2.2 酶法制備頭孢氨芐在頭孢氯芐酶法縮合反應(yīng)中,所使用的酶基本上是采用固定化技術(shù)處理得到的固定化青霉素酰化酶,而早期

12、使用的固定化細胞(細菌等形態(tài)的酶,因其形態(tài)結(jié)構(gòu)和性能方面的缺陷,已逐步被淘汰。目前所使用的圖3酶法制備頭孢唑林固定化酶,在生物工程菌的選育發(fā)酵、酶的提取、固定化載件的選擇和固定化技術(shù)等方面都有了長足的進步.已經(jīng)較好地解決了早期固定化酶在形態(tài)結(jié)構(gòu)和性能方面的缺陷;同時由于對固定化酶催化反應(yīng)機制和反應(yīng)動力學(xué)方面的深入研究,因此,在頭孢氨芐酶法合成中,固定化酶的使用壽命已經(jīng)大大延長。頭孢氨芐的酶催化縮合技術(shù)近年來的發(fā)展水平已相當(dāng)令人滿意。其中側(cè)鏈與母核7ADCA的投料比例已經(jīng)降低到1:12:1(分子比之間;反應(yīng)底物的濃度可以達到300600mmoL-14;反應(yīng)溫度控制在535,7-ADCA的轉(zhuǎn)化率可

13、以達到93%以上。在酶法制備頭孢氨芐技術(shù)中,產(chǎn)品分離與純化的方法是一項關(guān)鍵性技術(shù),由于所用的原料(苯甘氨酸衍生物、7ADCA和產(chǎn)物頭孢氨芐的理化性質(zhì)相近,采用普通的方法難以達到分離提純的目的,頭孢氨芐與萘酚形成復(fù)合物的方法是一個比較簡單可行的分離方法,反應(yīng)體系中的頭孢氨芐可以定量地與萘酚形成復(fù)合物而得到完全分離。采用一萘酚作為復(fù)合劑,其非常適合有酶存在的反應(yīng)體系,幾乎是定量地產(chǎn)生頭孢氨芐一萘酚復(fù)合物。酶法合成頭孢氨芐路線見圖4C H NH 2COR+N H 2O S N CH 3COOH C H NH 2CONH O S N CH 3COOHC 2CONHO S N CH 3COOH n OH

14、 /酸堿C H NH 2CONH O S NCH 3COOH 苯甘氨酸衍生物7-ADCA頭孢氨芐 頭孢氨芐萘酚復(fù)合物 頭孢氨芐R=NH 2OCH 2OC 2H 32.3 酶法制備頭孢拉定頭孢拉定(cephadine ,化學(xué)名為(6R ,7R -7-(2R -氨基-2-(1,4-環(huán)己二烯-1-基乙酰胺基-3-甲基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜二環(huán)4.2.0辛-2-烯-2-羧酸,是美國Squibb 公司開發(fā)的頭孢菌素類抗生素,1977年首次在日本上市,臨床用于治療敏感菌引起的支氣管炎、支氣管擴張感染、肺炎、腎盂腎炎、膀胱炎和尿道炎等。目前可用7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢霉烷酸(7-ADCA 和2,

15、5-二氫苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽(DHME 為原料,在磷酸鹽緩沖液中,經(jīng)固定化青霉素酰化酶(PGA 催化合成頭孢拉定5。見圖5圖4 D-苯甘氨酸衍生物和7-ADCA 酶法制備頭孢氨芐圖 5 頭孢拉定的酶法合成 3、展望 盡管酶促合成頭孢菌素類抗生素已取得了很大的進展，并且在某些產(chǎn)品的合成中已取得工業(yè)化應(yīng)用，但 仍然存在合成產(chǎn)率有待進一步提高等問題。在有機介質(zhì)中，一些酶表現(xiàn)出超活性，采用合適的有機介質(zhì)，可 以提高酯類側(cè)鏈的溶解度，減少側(cè)鏈的水解，從而提高轉(zhuǎn)化率?，F(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為綠色化學(xué)生產(chǎn) 提供了新途徑，頭孢菌素類抗生素酶促合成方法的實現(xiàn)是一個例證。酶法生產(chǎn)頭孢菌素類抗生素將提高抗生 素生產(chǎn)中能源和原材料的使用效率，減少三廢的排放滿足了經(jīng)濟、環(huán)境和社會進步的需要?？傊?，酶法合成 頭孢菌素類抗生素，有著廣闊的前景，相信隨著研究的深入，其必能和化學(xué)法相競爭，并日臻完善。 參考文獻： 1 2 22 3 陳希楊，王普，應(yīng)國清，等。酶法合成頭孢菌素類抗生素的研究進展（J ） ，浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002 ， 吳偉波，王旭，王娜，等。