二氧化硅生物熒光納米顆粒的制備與應(yīng)用

1、第33卷第4期 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) Vol.33 No.4 2007年8月 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Aug2007 文章編號(hào)：1007-1032(2007)04-0496-04二氧化硅生物熒光納米顆粒的制備與應(yīng)用謝文剛a，b(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)a.理學(xué)院；b.東方科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)摘 要：以熒光染料(聯(lián)吡啶釕配合物)為核，二氧化硅為外殼制備了熒光納米顆粒電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示， 合成的二氧化硅納米顆粒粒徑為(203) nm，分布均勻，形態(tài)規(guī)則對(duì)熒光納米顆粒進(jìn)行生物修飾得到熒光探針，

2、以DNA堿基配對(duì)原則為基礎(chǔ)建立檢測(cè)DNA的方法，利用激光掃描共聚焦顯微鏡研究玻片上的熒光信號(hào)和熒光強(qiáng)度結(jié)果表明，該方法不僅可定量檢測(cè)到4.4108 mol/L的目標(biāo)DNA3，而且可定性檢測(cè)目標(biāo)DNA3、單堿基錯(cuò)配DNA4及隨機(jī)序列DNA5，為發(fā)展DNA檢測(cè)技術(shù)提供了新的思路關(guān)鍵詞：熒光納米顆粒；核酸探針；DNA檢測(cè) 中圖分類號(hào)： O644文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ASynthesis and application of silicon dioxide biological fluorescent nanoparticlesXIE Wen-ganga，b(a. College of Sciences；b.

3、College of Orient Science Technology，HNAU，Changsha 410128，China)Abstract：The Fluorescence-doped silicon nanoparticles were synthesized in a microemulsion system of triton-100 /cyclohexane/ ammonia hydroxide and characterized by techniques of electron microscopy.Nanoparticles were modified with bioti

4、n-DNA1 in order to obtain fluorescence probeA method to monitor target DNA3 was set up on the basis of princile of DNA base complementary. Fluorescence signals were monitored by laser-scanning confocal microscopy for the detection of surface-bound fluorescent nanoparticlesThe results showed that tar

5、get DNA3 of 4.4108 mol/L can be monitored by this method，which can also identify target DNA3 and single base unmatched DNA4 and random DNA5 effectivelyThe method potentially serves as a useful platform in a number of biomedical applications where accurate and sensitive gene analysis is criticalKey w

6、ords：biological fluorescent nanoparticles；nucleic acid probe；DNA detect生命體內(nèi)痕量活性物質(zhì)的分析與檢測(cè)對(duì)獲取生命過程中的化學(xué)與生物信息、了解生物分子及其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、闡釋生命活動(dòng)的機(jī)理以及疾病生物熒光納米顆粒的成的診斷都具有重要意義1-3功研制為在復(fù)雜的環(huán)境中進(jìn)行最佳的單分子研究提供了條件生物熒光納米顆粒的粒徑為1100 nm，具有巨大的比表面、尺寸量子效應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)活性，使其與生物體有特殊的相互作用，并得到了廣泛應(yīng)用，如可實(shí)現(xiàn)對(duì)SmIgG+ B淋巴細(xì)胞、HepG肝癌細(xì)胞、WA系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病細(xì)胞和白血病收稿日期：2

7、007-01-10基金項(xiàng)目：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)科學(xué)基金(62020206002)作者簡(jiǎn)介：謝文剛(1966-)，男，湖南吉首人，碩士，副教授，主要從事生物無機(jī)化學(xué)方面的研究.特征細(xì)胞等的識(shí)別4-5但生物熒光納米顆粒在DNA檢測(cè)方面的應(yīng)用鮮有報(bào)道6為此，筆者利用微乳液法制備二氧化硅納米顆粒，并對(duì)其進(jìn)行生物修飾，以DNA-DNA的特異識(shí)別與結(jié)合作用為基礎(chǔ)，以三明治結(jié)構(gòu)為模型(勿需對(duì)檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行標(biāo)記) ，研究了生物熒光納米顆粒在DNA檢測(cè)中的應(yīng)用，旨在為發(fā)展新型DNA檢測(cè)技術(shù)提供依據(jù)1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料聯(lián)吡啶釕配合物(Ru(II)(bpy)32+.6H2O，F(xiàn)luka公司)，鏈霉親和素(美國

8、Sigma公司)，DNA片段(上海生工生物試劑有限公司合成)所用DNA的序列如下：第33卷第4期 謝文剛 二氧化硅生物熒光納米顆粒的制備與應(yīng)用 497DNA1：5-TTATAACTATTCCTA(A10)-biotin-3 (修飾探針)；DNA2：5-biotin-A10CTCCCTAATAACAAT-3 (固定探針)；DNA3：5-TAGGAATAGTTATAAATTGTTATT AGGGAG-3(檢測(cè)目標(biāo))；DNA4：5-TAGGAATAGTTTTAAATTGTTATT AGGGAG-3 (單堿基錯(cuò)配)；DNA5 5GTAATGAGTGAAAGGTATTTGTAG TTGAAT-3 (隨機(jī)

9、序列)溴化氰根據(jù)文獻(xiàn)7合成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)囼?yàn)用水均為二次蒸餾水主要儀器：日立F-2500型熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)340 nm)；19HW-1型恒溫磁力攪拌器；激光共聚焦顯微鏡FV500+IX70(日本)；高速冷凍離心機(jī)CR22G(日本) 1.2 方 法環(huán)己烷、正己醇、表面活性劑triton-100按411的比例混合，加入二次蒸餾水，攪拌至清，分別加入聯(lián)吡啶釕配合物溶液、正硅酸乙酯(TEOS)、氨水，持續(xù)攪拌24 h，反應(yīng)結(jié)束后用丙酮、二次蒸餾水洗滌，12 000 r/min離心分離，制得熒光納米顆粒，保存?zhèn)溆脵z測(cè)原理如圖1所示以熒光納米顆粒標(biāo)記寡核苷酸片段DN

10、A1為檢測(cè)探針，與目標(biāo)DNA3和固定探針DNA2進(jìn)行夾心式雜交，形成三明治結(jié)構(gòu)復(fù)合8體，用鏈酶親和素化的玻片對(duì)復(fù)合體進(jìn)行捕獲，洗滌，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)玻片上的熒光納米顆粒的熒光信號(hào)，并用軟件(Fluoview tiempo time course software ver5)分析熒光強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA3的檢測(cè)把熒光納米顆粒加入到碳酸鈉溶液中，超聲分散，加入溴化氰/乙腈溶液，室溫下攪拌，再分別用冰水和PBS(磷酸緩沖液，pH=7.4)溶液洗滌，顆粒置于PBS溶液中保存向鏈霉親和素溶液中加入已活化的熒光納米顆粒，在4 下攪拌24 h，用1 mol/L甘氨酸溶液封閉，離心、洗滌向顆粒中加

11、入生物素化的寡聚核苷酸(biotin-DNA1)(圖1-a，b)，常溫下反應(yīng)2 h，用PBS溶液洗去多余的生物素化DNA1溶液，熒光顆粒于4 保存?zhèn)溆秒s交后的溶液滴加在鏈霉親和素化的玻片上(圖1-e)，每一個(gè)濃度的DNA溶液點(diǎn)3個(gè)樣，玻片置于55 水浴鍋中培育，再分別用2SSC(含 0.2%SDS)，70%甲酰胺(含30 mmol/L NaCl)，1SSC (含0.1%SDS)，0.05SSC洗滌，晾干圖1 DNA的檢測(cè)原理Fig.1 Schematic representation of the analytical protocol2 結(jié)果與分析2.1 熒光納米顆粒的表征由圖2可知，熒光納

12、米顆粒的粒徑為(203) nm，表面光滑圓潤(rùn)，且納米粒子分布均勻498 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 2007年8月Magnification:100 000；d =(203) nm與玻片上的鏈霉親和素特異性地結(jié)合，從而把雜交復(fù)合體固定在玻片上(經(jīng)得起洗滌)，使玻片交聯(lián)熒光納米顆粒，產(chǎn)生熒光信號(hào)若體系不存在檢測(cè)目標(biāo)DNA3，通過洗滌，熒光顆粒洗去，玻片無熒光若體系中檢測(cè)目標(biāo)DNA3濃度較大，則有較多的熒光納米顆粒被固定在玻片上，產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)(見圖5)圖2 熒光納米顆粒的透射電子顯微鏡圖Fig.2 TEM micrograph of monodisperse fluorescent na

13、noparticle經(jīng)溴化氰活化的熒光納米顆粒，表面帶氰酸酯活性基團(tuán)，與鏈霉親和素蛋白中的氨基發(fā)生反應(yīng)，生成異脲衍生物9，將鏈霉親和素交聯(lián)在顆粒表面從圖3可明顯看出，熒光納米顆粒與鏈霉親和素反應(yīng)后，導(dǎo)致鏈霉親和素溶液熒光強(qiáng)度(340 nm)顯著下降，因此可確定鏈霉親和素已連接到熒光納米顆粒的表面將已修飾鏈霉親和素的熒光納米顆粒加入到生物素化的DNA1溶液中，由于鏈霉親和素-生物素的特異作用，使DNA1連接到納米顆粒上，導(dǎo)致溶液中DNA1的紫外吸收下降(260 nm)，如圖4所示為此，制得熒光探針圖4 DNA1紫外光譜Fig.4UV spectra of DNA1圖5 不同濃度目標(biāo)DNA3的熒光

14、強(qiáng)度Fig.5 Fluorescence intensity of different concentrations of the target DNA3對(duì)相同濃度的目標(biāo)DNA3、單堿基錯(cuò)配的DNA4及隨機(jī)序列DNA5和PBS對(duì)照所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理得到圖6從圖6可知，完全匹配的DNA3所檢測(cè)到的熒光信號(hào)比單堿基錯(cuò)配DNA3能與DNA1和DNA2完全匹配，經(jīng)過洗滌，熒光納米顆粒能固定在玻片上，從而產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào)而單堿基錯(cuò)配的DNA4及隨機(jī)序列DNA5由于不能與DNA1和DNA2完全匹配，形成的三明治結(jié)構(gòu)的雜交復(fù)合體在熱力學(xué)上是不穩(wěn)定的，雜交速度也不如前者，在洗滌時(shí)，熒光納米顆粒

15、被洗去，圖3 鏈酶親和素?zé)晒夤庾V 的DNA4及隨機(jī)序列DNA5的信號(hào)要高，這是因?yàn)镕ig.3Fluorescence spectra of streptavidinDNA3的檢測(cè)DNA的雜交以堿基互補(bǔ)配對(duì)為基礎(chǔ)，目標(biāo)DNA3能與DNA1和DNA2進(jìn)行夾心式雜交，形成三明治結(jié)構(gòu)復(fù)合體把雜交復(fù)合體轉(zhuǎn)移到鏈霉親和素化的玻片上，則固定探針DNA2上的生物素可以第33卷第4期 謝文剛 二氧化硅生物熒光納米顆粒的制備與應(yīng)用 499在玻片上產(chǎn)生較弱的熒光信號(hào)因此，該方法能將完全互補(bǔ)的單鏈DNA與非完全互補(bǔ)的單鏈DNA鑒別開來，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的定性檢測(cè)參考文獻(xiàn)：1 李朝輝，王柯敏，譚蔚泓硅殼包被的核殼型量子

16、點(diǎn)熒光納米顆粒的制備及其在細(xì)胞識(shí)別中的應(yīng)用J科學(xué)通報(bào)，2005，50(13)：1318-13222 Zhong Xiao-bo，Reynolds Robert，Judith R K，et alSingle-nucleotide polymorphism genotyping on optical thin-film biosensor chipsJPNAS，2003，100(20)：11559-115643 黃永華，龍 姝，蔡紅革N-萘酚醛-D-氨基葡萄糖席夫堿甘氨酸金屬配合物與DNA作用的譜學(xué)研究J. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，28(2)：156-158. 4 李 軍，王柯敏，

17、何曉曉納米尺度和單分子水平上的化學(xué)生物學(xué)研究J大學(xué)化學(xué)，2004，19(1)：11-15 5 朱詩國，唐 珂，向娟娟生物熒光氧化硅納米顆粒的研制與應(yīng)用J物理化學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19(4)：311-314 6 Csaki A，Straube W，F(xiàn)ritzsche W，et alDNA monolayeron gold substrates characterized by nanoparticle labeling and scanning force microscopyJNucleic Acids Research，2001，29(16)：1-57 日本化學(xué)會(huì)無機(jī)化合物合成手冊(cè)K曹惠民，譯第一卷北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1998：205-206 8 何曉曉，王柯敏，譚蔚泓基于生物熒光納米顆粒的新型熒光標(biāo)記方法及其在細(xì)胞識(shí)別中的應(yīng)用J科學(xué)通報(bào)，2001，46(16)：1353-13569 蔣中華，張津輝生物分子固定化技術(shù)及應(yīng)用M北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1998：26-28圖6 歸一化處理后DNA樣品的熒光強(qiáng)度Fig.6 No