質(zhì)粒DNA提取鑒定ppt課件

1、質(zhì)粒DNA提取、鑒定暨大醫(yī)學(xué)院生化教研室蔣建偉 質(zhì)粒是真核細(xì)胞細(xì)胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌(大腸桿菌）、酵母菌和放線菌等生物中細(xì)胞核或擬核中的DNA以外的DNA分子補(bǔ)充：部分質(zhì)粒為RNA） 。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體(Vector)。 有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進(jìn)真菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。 質(zhì)粒質(zhì)粒plasmidplasmid）：存在）：存在于細(xì)菌染色體外的小于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈型環(huán)狀雙鏈DNADNA分子，分子，可在宿主細(xì)胞中自主可在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，并在

2、細(xì)胞分裂復(fù)制，并在細(xì)胞分裂時傳給子代。時傳給子代。 質(zhì)粒感染細(xì)菌后，會質(zhì)粒感染細(xì)菌后，會賦予宿主細(xì)胞一些遺賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀如對青霉素傳性狀如對青霉素或重金屬的抗性或重金屬的抗性) )可作可作為篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)菌的為篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)菌的根據(jù)。根據(jù)。 質(zhì)粒分類： 嚴(yán)緊型每個細(xì)胞15個質(zhì)粒）， 當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時，質(zhì)粒也復(fù)制一次； 松弛型每個細(xì)胞10200個質(zhì)粒）。如果用一定的藥物處理還會使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。 一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。 質(zhì)粒的復(fù)制有時和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。 pBR322質(zhì)粒(4363

3、bp) : 主要包括：限制性內(nèi)切酶位點插入外源基因）；含有terr、ampr抗藥基因，可作為篩選標(biāo)志。含有復(fù)制起始點ori賦予其復(fù)制特性）。四環(huán)素抗性基因（Tetr失活( (插入失活法插入失活法) )抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇M13M13噬菌體：噬菌體： M13mpM13mp系列系列 pUCpUC系列系列 pUCpUC質(zhì)粒質(zhì)粒: :含含E.coliE.coli的的LacZLacZ的的N N端端146146個個AAAA殘基殘基的編碼基因，編碼產(chǎn)物為的編碼基因，編碼產(chǎn)物為半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的片段。片段。 LacLacE.coliE.coli突變型宿主細(xì)胞）：可表達(dá)該突變型宿主細(xì)胞）：可表達(dá)該

4、酶的酶的片段片段. .單獨存在的單獨存在的或或片段均無活性，只有宿主細(xì)片段均無活性，只有宿主細(xì)胞與克隆載體同時共表達(dá)兩片段，宿主細(xì)胞與克隆載體同時共表達(dá)兩片段，宿主細(xì)胞才有胞才有半乳糖苷酶活性，使特異底物產(chǎn)半乳糖苷酶活性，使特異底物產(chǎn)生藍(lán)色化合物生藍(lán)色化合物-互補(bǔ)互補(bǔ)) )。 互互補(bǔ)補(bǔ)的的檢檢測測片段片段片段片段片段片段片段片段本實驗： 大腸桿菌pEC-ct質(zhì)粒， pEC-ct質(zhì)粒：8.0kb (6.8kb) 有Hind , BamH 酶切點，可切出CD基因1.2kb） 本實驗包括： 1. 細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒擴(kuò)增 2. 菌體收集 3. 菌體裂解、質(zhì)粒DNA提取、純化 4. 鑒定2人一組操作操作細(xì)菌

5、的培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)接種：從接種：從-20取出菌種，斜面劃線接種，取出菌種，斜面劃線接種，37培養(yǎng)培養(yǎng)24h單克隆培養(yǎng)：單克隆培養(yǎng)：挑單個菌落，接種于挑單個菌落，接種于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)液中含含Amp50g/ml)4-6h。菌液菌液0.2ml10mlLB培養(yǎng)基含培養(yǎng)基含Amp50g/ml)37培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)過夜。周四A.M.10：00 每小組來一個代表，在林春蘭老師指導(dǎo)下完成。4. 擴(kuò)大培養(yǎng)：培養(yǎng)液3 ml,接種于60 mL 的LB培養(yǎng)液含Amp 50g/ml),振搖200 rpm， 37 (4-6 h), 使A5800.4-0.6。5. 加氯霉素：加氯霉素，終濃度40 g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)15-17

6、h.周五P.M.由林春蘭老師完成。周五A.M. 10:00 每小組來一個代表，在林春蘭老師指導(dǎo)下完成。周六周六8:00.去醫(yī)學(xué)院去醫(yī)學(xué)院7樓，樓，2人人/份份1.取取6個個1.5mlEppendorf管，分別加細(xì)菌培管，分別加細(xì)菌培養(yǎng)液養(yǎng)液1.4ml9000rpm2-3min 棄上清棄上清2.600lSTE液依次溶解各管沉淀，合并一管液依次溶解各管沉淀，合并一管再用再用200lSTE液清洗各管，清洗液合并上液清洗各管，清洗液合并上管收集菌體管收集菌體）9000rpm2-3min,棄上清棄上清（保留菌體）（保留菌體）收集菌體收集菌體3。沉淀懸于。沉淀懸于200ul溶液溶液I，混勻，混勻放置放置5

7、min4。加入。加入400ul溶液溶液II，顛倒混勻數(shù)十次，顛倒混勻數(shù)十次2030次）次）0.2NNaOH-1%SDS放置放置5min5。加入。加入300ul溶液溶液III，充分混勻溫和操作），充分混勻溫和操作）10min沉淀DNAKAc-HAc裂解堿裂解法提取質(zhì)粒堿裂解法提取質(zhì)粒DNARNase12000rpm3min 棄沉淀棄沉淀6。將上清轉(zhuǎn)移至另一。將上清轉(zhuǎn)移至另一Eppendorf管中，加管中，加0.6倍體積異丙醇倍體積異丙醇(540ul)，倒轉(zhuǎn)混勻，倒轉(zhuǎn)混勻室溫室溫5min離心離心12000rpm10min 棄上清棄上清沉淀干燥，室溫沉淀干燥，室溫5min7。加。加TE500ul溶解

8、沉淀溶解沉淀同時倒膠1%,330ml/小班沉淀質(zhì)粒去除基因組DNA和蛋白8。加入等體積飽和酚，振搖。加入等體積飽和酚，振搖1min，充分混勻，充分混勻12000rpm5min9。將上層水相轉(zhuǎn)移至另一。將上層水相轉(zhuǎn)移至另一Eppendorf管中，管中，用等體積氯仿用等體積氯仿-異戊醇抽提，振搖異戊醇抽提，振搖1min，充，充分混勻分混勻12000rpm5min10。將上層水相轉(zhuǎn)移至另一。將上層水相轉(zhuǎn)移至另一Eppendorf管中，管中，加入預(yù)冷的加入預(yù)冷的2.5倍體積無水乙醇倍體積無水乙醇-2030minLunch time純化質(zhì)粒純化質(zhì)粒易錯離心離心12000rpm10min 棄上清棄上清沉淀

9、干燥沉淀干燥11。加入。加入TE30-50-100ul,溶解沉淀溶解沉淀（反復(fù)吹打至（反復(fù)吹打至完全溶解）完全溶解）EP管上做記號質(zhì)粒的分離、純化半定量檢測濃度酶切電泳鑒定 鑒定質(zhì)粒 線性化質(zhì)粒，電泳后與marker比較，估計質(zhì)粒大小。 線性化： 用Hind將質(zhì)粒酶切、電泳，估計其分子大小。 雙酶切：用Hind和BamH 將質(zhì)粒pEC- CT所含的CD基因1.2kb片段切出。鑒定鑒定(質(zhì)粒分子量、純度及是否含有所需要質(zhì)粒分子量、純度及是否含有所需要DNA段段)(一一)酶解酶解雙酶切體系：雙酶切體系：單酶切體系：單酶切體系：sample5ulsample5ulBamH1ulHind1ulHind

10、1ul10buffer2.5ul10buffer2.5ulddH2O15.5ulddH2O16.5ul混勻，離心混勻，離心(瞬時瞬時)，37113。DNA濃度測定濃度測定溴乙錠熒光法溴乙錠熒光法(半定量法，一大組半定量法，一大組/板板)（1制備1 %瓊脂糖凝膠板塑料平皿中凝固后待用。（2點樣： 標(biāo)準(zhǔn)溶液 （Marker：老師加） 1.0 0.5 0.25 0.1 0.05 0.025 0.01 ug/ul 分別吸取1ul點于制好的瓊脂糖平板上 樣品 吸取1ul，滴加于瓊脂板上。 (3) 濃度測定： 避光，小時后，在紫外燈下觀察各點熒光強(qiáng)弱，從而 估計樣品DNA濃度。14。電泳。電泳1.制膠制膠2.點樣點樣（1質(zhì)粒提取液質(zhì)粒提取液5ul+TE15ul（2單酶切液單酶切液25ul（3雙酶切液雙酶切液25ul各加上樣液溴酚蘭各加上樣液溴酚蘭5ul（4Marker老師加老師加4小組小組3道道12道道Marker1道道畫示意圖 3.電泳電泳 電壓：電壓：120V2min100V0.5-1.0h 待溴酚藍(lán)走至待溴酚藍(lán)走至6-7cm左右，終止電泳。左右，終止電泳。 觀察結(jié)果：紫外燈下，照相。觀察結(jié)果：紫外燈下，照相。markerDL15000:15000,10000,7500,5000,2500,1000,250bp上樣液：上樣液：50甘油、甘