谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備及動力學(xué)研究ppt課件

1、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備及動力學(xué)研討 實驗內(nèi)容：實驗內(nèi)容： 一親和層析法制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶一親和層析法制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶 二測定酶活力、米氏常數(shù)和最大反二測定酶活力、米氏常數(shù)和最大反響速度響速度 三三Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量，計酚法測定蛋白質(zhì)含量，計算比活力算比活力谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶簡介谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶簡介 谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶Glutathion S-transferases，簡稱GSTs，EC2.5.1.18廣泛存在于動物和人體的各種組織，哺乳動物肝臟中含量最高，約占肝可溶性蛋白的10%。GST是機(jī)體內(nèi)一組具有重要解毒作用的同工酶家族，均為由兩個亞基組成的二聚體，相對分子質(zhì)量為45 00049 00

2、0，各同工酶的等電點不同，多為堿性同工酶。兔肝勻漿液及純化樣品SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜 GST參與芳香環(huán)氧化物、過氧化物和鹵化物的解毒作用，GST催化這些帶有親電中心的疏水化合物與復(fù)原型谷胱甘肽GSH的親核基團(tuán)GS反響，中和它們的親電部位，使產(chǎn)物水溶性添加，經(jīng)過一系列代謝過程，最后產(chǎn)物為巰基尿酸，被排出體外，從而到達(dá)解毒目的。另外，GST還能共價或非共價地與非底物配基以及多種疏水化合物結(jié)合，具有結(jié)合蛋白的解毒功能。 親和層析原理 有很多生物大分子與相應(yīng)的分子間具有專注的可逆結(jié)合的特性，如酶與其底物、抑制劑、輔助因子，抗體與抗原，核酸與互補的堿基序列、核酸聚合酶、結(jié)合蛋白，激素與其受體、載

3、體蛋白，細(xì)胞與其外表特異蛋白等等，它們依托分子間的氫鍵、范德華力進(jìn)展結(jié)合，這種專注的可逆結(jié)合力的稱為親和力。親和層析的方法就是根據(jù)具有親和力的生物分子間可逆地結(jié)合和解離的原理建立和開展起來的。 將一對能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基，與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián)，制成專注的親和吸附劑，當(dāng)被分別物隨著流動相經(jīng)過親和吸附劑時，親和吸附劑上的配基就有選擇地吸附待分別物質(zhì)，經(jīng)過解吸附使待分別物質(zhì)得以純化。 親和層析的優(yōu)點：專注性結(jié)合，分辨率高，操作簡單，經(jīng)過一次性操作即可得到較高純度的分別物質(zhì)；具有濃縮作用，可以從含量很低的溶液中得到高濃度的樣品；利用生物學(xué)的特異性進(jìn)展分別，所以分別條件

4、比較暖和，可以很好地堅持樣品原有的生物學(xué)性質(zhì)。親和層析法分別生物大分子表示圖親和層析法分別生物大分子表示圖配基 待分別的 生物分子a. 載體 手臂 配基 親和吸附劑b.d.與待分別物質(zhì)專注可逆結(jié)合的物質(zhì)c.樣品雜質(zhì) 親和層析介質(zhì)的制備 配基的選擇：選擇適宜的配基是親和層析中的重要環(huán)節(jié)，配基可以配基的選擇：選擇適宜的配基是親和層析中的重要環(huán)節(jié)，配基可以是有機(jī)小分子、生物大分子、染料等。根據(jù)待分別物質(zhì)在溶液中與配基是有機(jī)小分子、生物大分子、染料等。根據(jù)待分別物質(zhì)在溶液中與配基之間的親和力的大小和專注性等特性進(jìn)展選擇，經(jīng)過實驗來確定理想的之間的親和力的大小和專注性等特性進(jìn)展選擇，經(jīng)過實驗來確定理想的

5、配基。例如選擇酶的競爭性抑制劑、底物和輔助因子類配基可以純化酶，配基。例如選擇酶的競爭性抑制劑、底物和輔助因子類配基可以純化酶，選擇互補的堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶、核酸結(jié)合蛋白類配基可以選擇互補的堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶、核酸結(jié)合蛋白類配基可以純化核酸等等。在親和層析中，分別生物大分子的配基必需有適當(dāng)?shù)幕兓怂岬鹊?。在親和層析中，分別生物大分子的配基必需有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)能與活化基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)作用，有較高的偶聯(lián)率，偶聯(lián)后配基和被學(xué)基團(tuán)能與活化基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)作用，有較高的偶聯(lián)率，偶聯(lián)后配基和被分別生物大分子的專注結(jié)合特性不變，有效地分別目的產(chǎn)物；解吸附時分別生物大分子的專注結(jié)合特性不變，有效

6、地分別目的產(chǎn)物；解吸附時不破壞生物大分子的生物活性和理化性質(zhì)。不破壞生物大分子的生物活性和理化性質(zhì)。 載體的選擇：親和層析的載體普通是凝膠類層析介質(zhì)。普通比較理想載體的選擇：親和層析的載體普通是凝膠類層析介質(zhì)。普通比較理想的載體應(yīng)具備稀松的多孔網(wǎng)狀構(gòu)造，對于溶液具有良好的親水性、流動性的載體應(yīng)具備稀松的多孔網(wǎng)狀構(gòu)造，對于溶液具有良好的親水性、流動性和浸透性，大孔徑凝膠介質(zhì)可以有效地使凝膠內(nèi)部的羥基得到活化，以保和浸透性，大孔徑凝膠介質(zhì)可以有效地使凝膠內(nèi)部的羥基得到活化，以保證較高的活化效率，提高了配基的有效濃度，提供較高的親和容量；必需證較高的活化效率，提高了配基的有效濃度，提供較高的親和容量

7、；必需有足夠數(shù)量的化學(xué)基團(tuán)，經(jīng)化學(xué)方法活化后，可以與大量的配基相偶聯(lián)；有足夠數(shù)量的化學(xué)基團(tuán)，經(jīng)化學(xué)方法活化后，可以與大量的配基相偶聯(lián)；具有良好的機(jī)械性能，保證親和柱維持較好的流速；必需是不溶于水、化具有良好的機(jī)械性能，保證親和柱維持較好的流速；必需是不溶于水、化學(xué)惰性的，非特異性吸附作用弱；有良好的物理和化學(xué)的穩(wěn)定性，在配基學(xué)惰性的，非特異性吸附作用弱；有良好的物理和化學(xué)的穩(wěn)定性，在配基偶聯(lián)、親和層析、再生處置過程中不會因離子強度、溫度、偶聯(lián)、親和層析、再生處置過程中不會因離子強度、溫度、pH的變化，變的變化，變性劑、去污劑的運用而破壞載體的物理化學(xué)構(gòu)造，在介質(zhì)的反復(fù)運用過程性劑、去污劑的運用

8、而破壞載體的物理化學(xué)構(gòu)造，在介質(zhì)的反復(fù)運用過程中能抗微生物和酶的侵蝕。中能抗微生物和酶的侵蝕。 瓊脂糖凝膠：目前運用最多的瓊脂糖凝膠是瑞典Pharmacia公司消費的Sepharose，它具有理想載體的特性。它是由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖交替結(jié)合而成的大分子多聚糖，靠糖鏈之間的次級鍵交聯(lián)成的穩(wěn)定網(wǎng)狀構(gòu)造的珠狀凝膠，網(wǎng)狀構(gòu)造的疏密依托改動瓊脂糖濃度的方法來控制。如Sepharose 2B，4B和6B，其中阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分含量，機(jī)械強度隨凝膠濃度降低而減弱。目前廣泛運用Sepharose 4B來分別生物大分子， 本實驗采用的是本院本人研制的Sepharose QT4，相當(dāng)

9、于Sepharose 4B。瓊脂糖凝膠的多聚合鏈不是由共價鍵銜接而成的，在運用中該當(dāng)留意的問題有受熱失去穩(wěn)定性，引起部分溶解，故不宜加熱消毒，低溫保管，凍結(jié)會破壞其構(gòu)造，要防止在pH低于4高于9下長期義務(wù)，運用破壞氫鍵的試劑會降低凝膠的穩(wěn)定性，普通情況下不能進(jìn)展枯燥，適宜濕態(tài)保管。 常用活化劑：活化劑普通用溴化氰和環(huán)氧氯丙烷較多，二者各有常用活化劑：活化劑普通用溴化氰和環(huán)氧氯丙烷較多，二者各有利弊：利弊： (1)溴化氰：溴化氰活化載體是目前用得最多、效果最好的活化溴化氰：溴化氰活化載體是目前用得最多、效果最好的活化方法?；罨矢?，速度快。缺陷是溴化氰容易分解產(chǎn)生劇毒的氫氰方法?；罨矢?，速

10、度快。缺陷是溴化氰容易分解產(chǎn)生劇毒的氫氰酸及溴，活化臂短，不利于生物大分子的結(jié)合。酸及溴，活化臂短，不利于生物大分子的結(jié)合。 (2)環(huán)氧氯丙烷：環(huán)氧氯丙烷活化效率高，活化臂較長，有利于環(huán)氧氯丙烷：環(huán)氧氯丙烷活化效率高，活化臂較長，有利于生物大分子的結(jié)合。毒性很小，可以在常規(guī)條件下操作。缺陷是活化生物大分子的結(jié)合。毒性很小，可以在常規(guī)條件下操作。缺陷是活化溫度較高，溫度較高，4550，活化時間較長。，活化時間較長。 偶聯(lián)條件的選擇：偶聯(lián)條件的選擇： (1)偶聯(lián)偶聯(lián)pH值：配基偶聯(lián)最正確值：配基偶聯(lián)最正確pH在在8-10之間最有效，在這之間最有效，在這個個pH范圍內(nèi)配基上的氨基多是非質(zhì)子化方式，要

11、盡可以地選用堿范圍內(nèi)配基上的氨基多是非質(zhì)子化方式，要盡可以地選用堿性條件。但是在高性條件。但是在高pH值時，可以會改動配基的高級構(gòu)造，甚至喪值時，可以會改動配基的高級構(gòu)造，甚至喪失活性，所以在偶聯(lián)時失活性，所以在偶聯(lián)時pH的選擇要根據(jù)詳細(xì)情況而定。的選擇要根據(jù)詳細(xì)情況而定。 (2)偶聯(lián)溫度和時間：溴化氰活化的載體，普通都在偶聯(lián)溫度和時間：溴化氰活化的載體，普通都在4左右偶左右偶聯(lián)過夜，也可以室溫聯(lián)過夜，也可以室溫20-25下反響下反響2h。環(huán)氧氯丙烷活化的載。環(huán)氧氯丙烷活化的載體，普通在體，普通在3545偶聯(lián)。偶聯(lián)時間要根據(jù)配基的濃度來確定，偶聯(lián)。偶聯(lián)時間要根據(jù)配基的濃度來確定，普通情況要普通

12、情況要1624小時。小時。 (3)偶聯(lián)配基的濃度：偶聯(lián)時并不總是需求大量的配基才干制偶聯(lián)配基的濃度：偶聯(lián)時并不總是需求大量的配基才干制成高效的親和吸附劑，高濃度配基的偶聯(lián)可以添加結(jié)合強度、空間成高效的親和吸附劑，高濃度配基的偶聯(lián)可以添加結(jié)合強度、空間位阻和非特異性結(jié)合，空間位阻可以引起親和吸附劑結(jié)合效率的降位阻和非特異性結(jié)合，空間位阻可以引起親和吸附劑結(jié)合效率的降低，尤其是當(dāng)高濃度大分子蛋白被偶聯(lián)時。對于多數(shù)親和吸附劑選低，尤其是當(dāng)高濃度大分子蛋白被偶聯(lián)時。對于多數(shù)親和吸附劑選用的配基濃度是用的配基濃度是1-20mol/mL gel，2mol/mL是最常用的配基運是最常用的配基運用量。用量。親

13、和層析技術(shù) 吸附條件的選擇吸附條件的選擇 ：純化生物大分子普通采用柱層析吸：純化生物大分子普通采用柱層析吸附法，根據(jù)親和吸附劑的吸附容量和待分別物質(zhì)的總量選擇附法，根據(jù)親和吸附劑的吸附容量和待分別物質(zhì)的總量選擇大小適宜的層析柱。選擇吸附條件時要思索平衡緩沖液的組大小適宜的層析柱。選擇吸附條件時要思索平衡緩沖液的組成、成、pH范圍和離子強度，樣品上柱的體積、溫度和流速等范圍和離子強度，樣品上柱的體積、溫度和流速等要素，使親和介質(zhì)與被分別物質(zhì)具有較強的親和力。樣品溶要素，使親和介質(zhì)與被分別物質(zhì)具有較強的親和力。樣品溶液的液的pH和離子強度要與平衡緩沖液一致，普通接近中性。和離子強度要與平衡緩沖液一

14、致，普通接近中性。假設(shè)樣品中雜質(zhì)多，純化對象與配基結(jié)合力弱時，可以控制假設(shè)樣品中雜質(zhì)多，純化對象與配基結(jié)合力弱時，可以控制樣品上柱的流速或反復(fù)過柱，以使純化對象與配基間充分起樣品上柱的流速或反復(fù)過柱，以使純化對象與配基間充分起作用。樣品上柱后，用平衡緩沖液除去未吸附的雜蛋白，也作用。樣品上柱后，用平衡緩沖液除去未吸附的雜蛋白，也可以用較高離子強度的鹽溶液進(jìn)一步洗去非專注吸附的雜質(zhì)，可以用較高離子強度的鹽溶液進(jìn)一步洗去非專注吸附的雜質(zhì)，盡可以在親和柱上只留下專注吸附的結(jié)合物。盡可以在親和柱上只留下專注吸附的結(jié)合物。 洗脫條件的選擇 ：親和層析的洗脫屬于特異性的解離方式，洗脫劑的選擇必需不引起待分

15、別物的變性失活。洗脫劑多數(shù)采用改動層析條件如改動pH、離子強度或緩沖液組成的方法，使固定化配基和生物大分子之間的親和力降低，以致解開二者的結(jié)合。主要有幾種根本洗脫類型： (1)競爭性洗脫：特異的配基競爭性洗脫或底物競爭性洗脫，即在洗脫液中參與與親和吸附劑上一樣或不同的配基，這些水溶性的配基和固定相配基相互競爭與大分子結(jié)合，由于前者游離的配基較高，結(jié)合力大大超越后者時，將被吸附的大分子洗脫下來。運用親和力更強的配基或底物洗脫效果更好。洗脫液中配基或底物的濃度要根據(jù)配基與結(jié)合物親和力的大小來決議。 (2)離子強度洗脫：洗脫液離子強度添加有利于洗脫，可以是一步法或梯度變化，在強離子的作用下，使親和層

16、析的結(jié)合力減弱，將被吸附物洗脫下來。添加鹽濃度可以使被吸附物解吸附，NaCl是最常用的鹽。 (3)pH離子強度洗脫：pH的變化改動結(jié)合位點上帶電基團(tuán)的離子化程度，解吸附普通是降低pH， pH運用的限制要思索載體、配基和被吸附物質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性。pH變化和離子強度雙重作用洗脫適宜結(jié)合得比較牢的物質(zhì)。 (4)變性劑洗脫：有的蛋白質(zhì)在親和介質(zhì)上結(jié)合得比較結(jié)實，在一定濃度的變性劑中有較好的穩(wěn)定性，這樣可以在洗脫液中參與變性劑，如鹽酸胍，尿素等，有利于蛋白質(zhì)的解離。另外，親和介質(zhì)多次運用后，柱效下降，用變性劑可以將吸附比較結(jié)實的雜質(zhì)洗凈，使親和介質(zhì)再生。 (5)化學(xué)斷裂：當(dāng)一些蛋白質(zhì)與親和吸附劑結(jié)合結(jié)實，

17、上述洗脫方法或用上述方法洗脫被吸附的大分子會發(fā)生不可逆失活時，可以采用專注的化學(xué)方法將配基和載體之間的銜接鍵裂解，獲得配基蛋白質(zhì)復(fù)合物。這個方法的缺陷是親和吸附劑運用一次后，需求重新與配基偶聯(lián)后，才干再次運用。 洗脫方式：親和層析的洗脫方式，原那么上與離子交換層析的洗脫方式類似，主要有以下三種方式： (1)一步洗脫：屬于非選擇性洗脫方法，運用于高度特異性吸附劑的結(jié)合，經(jīng)過一次洗脫將被吸附物質(zhì)全部洗脫下來，就可得到較純的分別物。非選擇性洗脫主要受洗脫液的pH、離子強度、溫度和介電常數(shù)等要素的影響，有效的洗脫液既能改動被吸附蛋白質(zhì)的構(gòu)象以降低蛋白質(zhì)與配基之間的親和力，又不破壞蛋白質(zhì)和親和吸附劑的穩(wěn)

18、定性。 (2)分步洗脫：屬于選擇性洗脫方法，運用于基團(tuán)特異性吸附劑，親和吸附劑上吸附有特異性不盡一樣的多組分樣品，用幾種不同的洗脫條件分幾步洗脫，可以將親和力大小不同的組分分開。 (3)梯度洗脫：屬于選擇性洗脫方法，利用洗脫液的濃度梯度變化，即解吸附才干逐漸加強，對于吸附性質(zhì)一樣、特異性程度不同的酶和同工酶有效地洗脫。梯度洗脫比分步洗脫更有可以得到較純的分別對象。此方法需求有梯度混合儀來實現(xiàn)洗脫液的梯度變化。 影響親和層析的主要要素影響親和層析的主要要素 ： (1)樣液體積的影響：在平衡條件下分別對象與固定化配基能嚴(yán)樣液體積的影響：在平衡條件下分別對象與固定化配基能嚴(yán)密結(jié)合時，樣品溶液上柱時對

19、體積要求不很嚴(yán)峻，親和吸附劑的吸密結(jié)合時，樣品溶液上柱時對體積要求不很嚴(yán)峻，親和吸附劑的吸附總?cè)萘磕鼙怀浞掷?。與吸附劑結(jié)合力弱的樣品濃度要高，防止附總?cè)萘磕鼙怀浞掷?。與吸附劑結(jié)合力弱的樣品濃度要高，防止和非吸附物質(zhì)一同流掉。和非吸附物質(zhì)一同流掉。 (2)流速的影響：發(fā)生親和吸附時配基與生物大分子之間到達(dá)結(jié)流速的影響：發(fā)生親和吸附時配基與生物大分子之間到達(dá)結(jié)合反響平衡是一個緩慢的過程，因此樣品上柱的流速應(yīng)保證被結(jié)合合反響平衡是一個緩慢的過程，因此樣品上柱的流速應(yīng)保證被結(jié)合物與配基之間有足夠的時間到達(dá)吸附平衡，尤其是弱的親和吸附劑。物與配基之間有足夠的時間到達(dá)吸附平衡，尤其是弱的親和吸附劑。假

20、設(shè)流速較快，樣品中蛋白質(zhì)濃度又相對高時，往往有少量的待分假設(shè)流速較快，樣品中蛋白質(zhì)濃度又相對高時，往往有少量的待分別樣品和雜蛋白一同流出柱子，所以親和層析上柱樣品濃度大時，別樣品和雜蛋白一同流出柱子，所以親和層析上柱樣品濃度大時，如組織勻漿液、腹水等，上柱前可將溶液適度稀釋，降低溶液的粘如組織勻漿液、腹水等，上柱前可將溶液適度稀釋，降低溶液的粘度并使親和吸附反響完全。洗脫時為得到鋒利的洗脫峰、被分別物度并使親和吸附反響完全。洗脫時為得到鋒利的洗脫峰、被分別物最小的洗脫體積和最大的回收，普通采用低的洗脫速度。最小的洗脫體積和最大的回收，普通采用低的洗脫速度。 (3) 柱長的影響：多數(shù)情況下根據(jù)親

21、和介質(zhì)的吸附容量和待純柱長的影響：多數(shù)情況下根據(jù)親和介質(zhì)的吸附容量和待純化樣品的總量確定柱子的大小。假設(shè)親和介質(zhì)的吸附容量高，可選化樣品的總量確定柱子的大小。假設(shè)親和介質(zhì)的吸附容量高，可選擇較短的柱子，用較慢的線性流速，使待分別物質(zhì)得以快速分別；擇較短的柱子，用較慢的線性流速，使待分別物質(zhì)得以快速分別；假設(shè)親和吸附劑的親和性很低，選擇相對較長的柱子，保證待分別假設(shè)親和吸附劑的親和性很低，選擇相對較長的柱子，保證待分別物與親和介質(zhì)有充分接觸的時間，使二者較好地結(jié)合。物與親和介質(zhì)有充分接觸的時間，使二者較好地結(jié)合。 (4) 溫度的影響：溫度效應(yīng)在親和層析中非常重要，親和介質(zhì)溫度的影響：溫度效應(yīng)在親和層析中非常重要，親和介質(zhì)的吸附強度隨溫度升高而減小。所以在親和層析中可以利用不同的的吸附強度隨溫度升高而減小。所以在親和層析中可以利用不同的溫度吸附和洗脫有利于蛋白質(zhì)的親和純化，以得到親和層析最好的