SDS_聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法

1、128中國生化藥物雜志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2011年第32卷第2期SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法胡曉倩，陳來同，趙健(北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100871)摘250要:目的建立一種操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、無毒的蛋白質(zhì)電泳染色方法。方法利用考馬斯亮藍(lán)G-(CBBG-250)在SDS-PAGE)后對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行染色，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-對(duì)不同染色條件進(jìn)行探討，并與250(CBBR-250)染色法進(jìn)行比較。結(jié)果CBBG-250染色法試劑無毒，考馬斯亮藍(lán)R-背景淺，經(jīng)改良其靈敏度與CBBR-250染色法相當(dāng)，250染色方法簡(jiǎn)

2、單經(jīng)濟(jì)，達(dá)到0105g。結(jié)論CBBG-靈敏度能夠滿足一般要求，適用于蛋白質(zhì)電泳結(jié)果的快速分析。250;靈敏度關(guān)鍵詞:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳;染色方法;考馬斯亮藍(lán)G-中圖分類號(hào):Q503文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A1678(2011)02-0128-03文章編號(hào):1005-InvestigationofproteinstainingprotocolsofSDS-polyacrylamidegelelectrophoresisHUXiao-qian，CHENLai-tong，ZHAOJian(SchoolofLifeSciences，PekingUniversity，Beijing100871，China)

3、Abstract:PurposeToestablishasimple，rapid，highlysensitive，non-toxicproteinelectrophoresisstainingprotocolMethodsByutilizingCoomassieBrilliantBlueG-250(CBBG-250)tostainthepro-teinbandsbySDS-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE)，thedifferentdyeingconditionswereexploredandcomparedtothestainingofCoo

4、massieBrilliantBlueR-250(CBBR-250)ResultsCBBG-lightbackgroundandcomparablesensitivityafteroptimizationto250stainingprotocolpresentsnon-toxic，CBBR-250staining，whichisreaching01-05gConclusionCBBG-250stainingprotocolissimpleandeconomicItssensitivitycouldmeetthegeneralrequirements，andisapplicabletothera

5、pidanalysisofproteinelectrophoresisKeywords:SDS-PAGE;stainingmethod;CoomassieBrilliantBlueG-250;sensitivity蛋白質(zhì)條帶染色是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1(SDS-PAGE)中的重要步驟，染色方法有多種，考250(CBBR-250)(三苯基甲烷)染色法馬斯亮藍(lán)R-是生化實(shí)驗(yàn)室中蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)和定量分析常用的250(CBBG-250)分子結(jié)構(gòu)略方法?？捡R斯亮藍(lán)G-有不同，是一種甲基取代的三苯基甲烷，廣泛應(yīng)用于2蛋白質(zhì)溶液濃度測(cè)定，因其電泳染色靈敏度稍250差，應(yīng)用較少。研究表明，酸性條件下CB

6、BG-分子的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)通過疏水相互作用形成聚集3體，在電泳染色中染料是以聚集體的形式與蛋白質(zhì)結(jié)合，高濃度的硫酸銨可以使染料分子的聚集體4-5，增加，提高染色靈敏度并降低背景用中性鹽作6為脫色液可以快速無毒地達(dá)到很好的效果。本250的染色液2為基礎(chǔ)，文以BradfordCBBG-對(duì)SDS-PAGE凝膠的染色條件進(jìn)行探討和改良，力求建立一種更簡(jiǎn)便快速、靈敏的蛋白質(zhì)條帶染色方法。1材料大腸桿菌DH5菌株提取液來自本院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室;blueplusproteinmarker(包含6種已知相Mr16000對(duì)分子質(zhì)量(Mr)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，94000)，北京全式金生物技術(shù)有限公司;CBBG-250，Am

7、resco公司;牛血清白蛋白(BSA)(進(jìn)口分裝)，北京中北林格科技發(fā)展有限公司。SE250小型垂直板電泳槽及電源，瑞典GE公司;HEIOS紫外-可見分光光度計(jì)，英國UNICAM公司;凝膠成像儀，法國VilberLourmat公司;脫色搖床，美國Parmer公司。2方法01-26收稿日期:2010-作者簡(jiǎn)介:胡曉倩，女，工程師，主要從事生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和Email:huxiaoqianpkueducn。研究工作，中國生化藥物雜志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2011年第32卷第2期12921試劑配制211CBBG-250染色液CBBG-2501

8、00mg，無85%磷酸100mL，水乙醇50mL，用去離子水稀釋至1000mL，濾紙過濾備用。212固定液含50%甲醇或50%乙醇，10%乙40%去離子水。酸，213脫色液7%乙酸溶液或025mol/L氯化鉀溶液。22SDS-PAGE7電泳方法參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，采用5%濃縮膠，12%分離膠(凝膠厚度1mm)進(jìn)行SDS-1沒有經(jīng)過固定即染色;2固定液含50%甲醇，固定05h;3固定液含50%甲醇，固定1h;4固定液含50%乙醇，固定05h;5固定液含50%乙醇，固定1h1Stainingwithoutfixation;2Containing50%Methanol，fixedfor05fixe

9、dfor1h;4Containing50%Etha-h;3Containing50%Methanol，nol，fixedfor05h;5Containing50%Ethanol，fixedfor1hPAGE電泳。電泳完畢取出凝膠，置于不同成份的固定液中固定051h;然后將凝膠置于不同成份的染色液中，振蕩染色13h或過夜;棄去染色液，將凝膠置于不同成份的脫色液中脫色;對(duì)凝膠進(jìn)行照相。23根據(jù)CBBG-250顯色反應(yīng)的機(jī)理探討SDS對(duì)染色的影響250染色液(含15g/mLBSA，對(duì)CBBG-2g/mLSDS或含15g/mLBSA和2g/mLSDS)在320800nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，觀察SDS對(duì)

10、染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的影響。3結(jié)果與討論31固定液的成份及固定時(shí)間對(duì)染色效果的影響電泳過程按照常規(guī)操作，固定液中含50%甲醇圖1Fig1staining固定液的成份及固定時(shí)間對(duì)染色效果的影響Theeffectoffixativecompositionandfixedtimeonthe1染色1h;2染色2h;3染色3h;4染色過夜1Stainingfor1h;2Stainingfor2h;3Stainingfor3h;4Stainingforovernight圖2Fig2CBBG-250染色時(shí)間對(duì)染色效果的影響TheeffectoffixedtimeofCBBG-250onthestaining或5

11、0%乙醇，其它成分相同，固定時(shí)間05或1h做比較。染色結(jié)果顯示，固定步驟是必需的，含50%甲醇固定05h即可進(jìn)行染色，但固定1h染色效果更佳;含50%乙醇固定時(shí)間05h染色效果稍差，固定1h以上可達(dá)到同樣效果;固定過程中更換固定液可以加強(qiáng)固定效果(圖1)?？梢娨掖纪耆梢蕴娲状甲鳛楣潭ㄒ旱挠行С煞?，降低固定液的毒性。32CBBG-250染色時(shí)間對(duì)染色效果的影響250電泳和固定過程按照常規(guī)操作，用CBBG-2，3h或過夜，染色液染色1，結(jié)果表明染色1h已能初步觀察結(jié)果，染色3h蛋白質(zhì)條帶顏色已到達(dá)飽和，與染色過夜的結(jié)果相當(dāng)(圖2)。所以染色2h能夠基本滿足要求，對(duì)于濃度較低的樣品可適當(dāng)延長染色

12、時(shí)間。33CBBG-250染色液中磷酸的含量對(duì)染色效果的影響15%，對(duì)染色液中含85%磷酸分別為10%，20%時(shí)進(jìn)行染色試驗(yàn)，結(jié)果顯示當(dāng)染色液中含10%的85%磷酸時(shí)染色效果最好。反應(yīng)體系的酸度影響染料分子的質(zhì)子化程度，從掃描光譜看到吸收峰3的高度和位置均發(fā)生變化。當(dāng)染色液中含有10%的85%磷酸時(shí)，染料分子的磺酸基仍然多處于解離狀態(tài)，利于與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸殘基結(jié)合。當(dāng)染色液中含有15%以上的85%磷酸時(shí)，染料分子的聚集程度增加使得部分染料分子沉淀出來，造成染色效果較差。34CBBR-250與CBBG-250染色靈敏度的比較用不同濃度的BSA溶液作為樣品進(jìn)行電泳，利250和CBBG-250

13、兩種染色液分別染色，用CBBR-CBBR-250的染色靈敏度達(dá)到01g，CBBG-250250染色液中加的染色靈敏度僅1g。在CBBG-入10%硫酸銨，可使其染色靈敏度提高到0105g(圖3)，250的染色水平?；灸苓_(dá)到CBBR-試驗(yàn)結(jié)果顯示高濃度的硫酸銨能促進(jìn)染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，在提高染色靈敏度的同時(shí)沒有加深背景。35脫色液的改良CBBG-250染色后背景很淺，對(duì)于濃度高的樣品可以直接觀察到條帶，利用7%乙酸漂洗2h即可130中國生化藥物雜志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2011年第32卷第2期ACBBG-250染色液;BCBBG-250染

14、色液(含15g/mLBSA);CCBBG-250染色液(含2g/mLSDS);DCBBG-250染色液(含15g/mLBSA和2g/mLSDS)ACBBG-250染色;BCBBG-250染色，染色液中含10%硫酸銨AStainedbyCBBG-250;BStainedbyCBBG-250containing10%(NH4)2SO4ACBBG-250dye;BCBBG-250dye(containing15g/mLBSA);CCBBG-250dye(containing2g/mLSDS);DCBBG-250dye(containing15g/mLBSAand2g/mLSDS)圖3Fig32502

15、50染色靈敏度的影響硫酸銨對(duì)CBBG-圖4Fig4SDS對(duì)CBBG-250染色的影響Theeffectof(NH4)2SO4onthesensitivityofCBBG-TheeffectofSDSonCBBG-250staining脫去背景的顏色。試用025mol/L氯化鉀溶液進(jìn)行脫色比乙酸脫色效果更明顯，條帶更清晰，且無毒無味，利于環(huán)保。36SDS對(duì)CBBG-250染色的影響250染色液及含有BSA和SDS的染對(duì)CBBG-色液在320800nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，從掃描圖譜(圖4)觀察到，CBBG-250染色液在465和645nm有吸收峰，當(dāng)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后，在595nm處出現(xiàn)了一個(gè)峰與64

16、5nm的峰疊加;當(dāng)染色液中含有SDS時(shí)，染料分子及其與蛋白質(zhì)結(jié)合后的掃描曲線均發(fā)生了變化，第2個(gè)峰移到660nm，且595nm處的吸收變得不明顯。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)SDS的存在確實(shí)影響染色效果，其原因可能是由于SDS易于與蛋白質(zhì)結(jié)合，它的存在干擾染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而影響染色效果。實(shí)驗(yàn)表明在固定步驟中更換固定液能更好地除去SDS，染色效果更好。4結(jié)論250染色本研究結(jié)果表明，通過采用CBBG-法，乙醇完全可以替代甲醇作為固定液的有效成分，這樣可以降低固定液的毒性，使操作更加安全;染色液中含10%的85%磷酸時(shí)染色效果最好，在染色液中加入10%硫酸銨，可使其染色靈敏度明顯提高，染色2h能夠達(dá)到最佳效

17、果，對(duì)于濃度較低的樣品可適當(dāng)延長染色時(shí)間;用025mol/L氯化鉀溶液替代7%乙酸溶液漂洗脫色效果更明顯，條帶更清晰，且無毒無味，有利于環(huán)保;此外固定步驟很重要，更換固定液能更好地除去SDS，染色效果更好。雖然CBBG-250染色法靈敏度略遜于CBBR-250染色250的法，但是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)的改良基本能達(dá)到CBBR-250能快速染色水平。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于CBBG-結(jié)合蛋白質(zhì)，染色時(shí)間短，而背景顏色很淺，易于脫色，對(duì)于蛋白質(zhì)含量較大的樣品染色1h不經(jīng)脫色即可觀察結(jié)果，并且重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，所以CBBG-250染色法是一種經(jīng)濟(jì)快捷實(shí)用的方法，適用于蛋白質(zhì)電泳定量分析，值得推廣使用。參考文獻(xiàn):1郭堯君

18、蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)M2版北京:科學(xué)出版社，2005:63-782BradfordMMArapidsensitivemethodforthequantitationofmi-crogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dye1976，72:248-254bindingJAnalBiochem，3曹穩(wěn)根，焦慶才，劉茜，等考馬斯亮藍(lán)顯色劑變色反應(yīng)機(jī)理J化學(xué)學(xué)報(bào)，2002，60(9):1656-1661的研究4NeuhoffV，AroldN，TaubeD，etalImprovedstainingofproteinsinpolyacrylamidegelsincludingisoelectricfocusinggelswithclearbackgroundatnanogramsensitivityusingCoomassieBrilliantBlueJEle