江蘇地區(qū)不同類型乙型肝炎患者HBV基因分型研究

1、    江蘇地區(qū)不同類型乙型肝炎患者HBV基因分型研究            作者：李桂珍，劉興祥，王興時間：2007-11-22 11:42:00                     【關鍵詞】  肝炎病毒,乙型；基因型；聚

2、合酶鏈反應HBV genotyping in hepatitis B patients in Jiangsu province【Abstract】  AIM: To investigate the distribution of hepatitis B virus (HBV) genotypes of hepatitis B patients in Jiangsu province and analyze the relationship of HBV genotypes with the serum HBV DNA levels of patients. METHODS: The

3、HBV genotypes and HBV DNA levels of 176 patients in Jiangsu province were detected by realtime quantitative PCR and Taqman MGB probe technology.RESULTS: Among 176 HBVinfected patients, the proportions of genotype C, BC mixedtype, B, A and D were 66.5%(117/176), 22.7%(40/176), 5.1%(9/176), 0.6%(1/176

4、) and 0.6%(1/176), respectively. The results showed there were significant differences between genotype C and genotype BC mixedtype in HBV DNA load(P<0.05), and the HBV DNA level of genotype BC mixedtype was significantly higher than that of genotype C. The rate of genotype C among the patients o

5、f chronic hepatitis B was 71.4%, higher than that among the patients of acute hepatitis B, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma, but it showed no significant differences in the various clinical types of HBV infection tested(P>0.05). CONCLUSION: Genotype C and genotype BC mixedtype are the

6、 two dominant genotypes in the patients in Jiangsu province, and genotype B, A, and D are also found, but not common.  The HBV DNA load of genotype B, C mixedtype is significantly higher than that of genotype C.【Keywords】  Hepatitis B Virus; Genotype; polymerase chain reaction【摘要】  目的

7、： 了解江蘇地區(qū)乙型肝炎病毒基因型分布特征，探討HBV各基因型與血清HBV DNA水平的關系. 方法：采用熒光定量PCR結合Taqman MGB探針技術，對江蘇地區(qū)176份乙型肝炎患者血清中的HBV DNA進行基因分型和定量檢測. 結果：176例血清中，C型117人（66.5%），B, C型40人（22.7%），B型9人（5.1%），D型1人（0.6%），A型1人(0.6%). C型與B, C混合型在HBV DNA水平上存在統(tǒng)計學差異（P<0.05），B, C混合型的HBV DNA水平明顯高于C型. C基因型在慢性乙型肝炎患者中的所占比例（71.4%）比在急性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者中

8、所占的比例較高，但差異無統(tǒng)計學意義. 結論： 江蘇地區(qū)HBV基因型以C型為主, B, C混合型次之，B型較少，D型,A型極少；B, C混合型患者的HBV DNA數(shù)量水平高于C型. 【關鍵詞】  肝炎病毒，乙型；基因型；聚合酶鏈反應0引言乙型肝炎病毒(HBV)為一雙鏈DNA病毒，主要引起急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌，其基因序列高度變異，目前HBV已分為AH 8種基因型1，HBV基因型呈一定的地域性分布. 國外研究發(fā)現(xiàn)，HBV基因型與臨床表現(xiàn)、預后、治療應答均有一定關系，不同基因型具有不同的致病性，HBV基因型與肝癌發(fā)生率也存在一定相關性，HBV DNA水平與其基因型之間有無關系

9、存在爭議. 國內研究多集中在研究某地區(qū)乙型肝炎患者HBV基因型的組成與分布上，關于HBV基因型與HBV DNA水平、肝病嚴重程度等之間的關系等方面的研究還比較少，研究結果也多存在爭議. 本研究采用熒光定量PCR結合Taqman MGB探針技術，對江蘇淮安地區(qū)176例乙型肝炎患者進行HBV基因分型和HBV DNA定量檢測，探討HBV各基因型與血清HBV DNA水平的關系.1材料和方法1.1材料176份HBV感染血清均于200509/200602采自江蘇省淮安市第四人民醫(yī)院門診和住院患者，其中急性乙型肝炎19例，慢性乙型肝炎119例，肝硬化及肝癌38例. 其中，男性134例，女性42例，年齡107

10、7（平均年齡37.5）歲，診斷標準符合2000年第十次全國傳染病與寄生蟲病學會和肝病學分會聯(lián)合修訂的病毒性肝炎防治方案2. GeneAmpR5700 Sequence Detection System為美國PE公司產(chǎn)品. HBV基因分型熒光PCR檢測試劑盒，由杭州博賽基因診斷技術有限公司提供； HBVPCR熒光定量檢測試劑盒由上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司提供，檢測靈敏度為4.2×102 IU/L. 1.2方法1.2.1HBV DNA定量檢測HBV DNA濃度測定采用熒光定量PCR法，HBV DNA提取按操作說明. 1.2.2HBV DNA基因分型檢測血清標本50

11、L加核酸提取液50  L，振蕩10 s. 100干浴10 min，14593 g離心10 min，上清液即可用作PCR反應的模板. 基因擴增時，取上清液4 L分別加入含有36.4 L各型基因型混合液的反應管中，混勻，14593 g離心數(shù)秒，反應管置于5700定量熒光儀上，反應條件為37×2 min，94×2 min；再按94×10 s62×40 s，循環(huán)40次，熒光檢測在62，熒光通道檢測選擇FAM. 統(tǒng)計學處理：  計量數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用方差分析及LSDt檢驗. 計數(shù)資料組間比較采用2檢驗.2結果2.

12、1176例患者的HBV基因分型及其分布對江蘇地區(qū)176例不同臨床類型的HBV患者進行基因分型，本研究檢測到5種類型的基因型，構成比由高到低依次為：C型66.5%（117/176），B， C混合型22.7%（40/176），B型5.1%（9/176），A型0.6%（1/176），D型0.6%（1/176），無法分型4.5%（8/176）. 因此，C型和B, C混合型是該地區(qū)HBV的優(yōu)勢基因型，B型較少，A型和D型都只檢測到1例，沒有發(fā)現(xiàn)E, G, H等基因型. 慢性乙型肝炎患者中的HBV基因型與急性乙型肝炎、肝硬化或肝癌患者中的相比，C基因型所占比例較高（71.4%），但經(jīng)2檢驗，差異無統(tǒng)計學意

13、義（P>0.05）.表1乙型肝炎病毒基因分型檢測結果及分布（略）2.2HBV基因型與HBV DNA數(shù)量水平的關系176份急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中HBV  DNA含量在2.01×1038.97×109 IU/mL之間，均值為7.96×106 IU/mL；HBV各基因型與其DNA數(shù)量水平如表2所示. 經(jīng)分析，C型與B,C混合型在HBV DNA水平上存在統(tǒng)計學差異（P<0.05），B, C混合型的HBV DNA水平明顯高于C型. C型與B型（P>0.05）,B型與B, C混合型患者（P>0.05）的HBV DN

14、A水平?jīng)]有統(tǒng)計學差異. 無法分型的8例樣本的HBV DNA水平為（3.53±0.46） log10IU/mL，定量值均低于1.0×104 IU/mL，可能因其濃度較低，不適宜做乙肝病毒基因型的測定.表2HBV基因型與DNA數(shù)量水平的關系（略）注： 因A型、D型只有1例，用其HBV DNA數(shù)量表示.3討論既往流行病學調查表明HBV基因型呈一定的地理區(qū)域分布，我國主要以HBV C型和B型感染為主，也存在A型、D型及B和C型混合感染. 目前認為，不同地區(qū)優(yōu)勢基因型反映了HBV自然感染史發(fā)生的變異特點，是病毒變異后進化的結果. 肖揚、周岳進等3對浙江溫州地區(qū)966例患者HBV分型研

15、究顯示，66.46%為C型，20.49%為B型，B, C混合型為11.08%. 李雅娟等4對北京、長春、漢川、深圳、清遠和南京等6個城市的445例HBV感染者進行研究發(fā)現(xiàn)，53.7%為C型、32.6%為B型，13.7%為B和C型混合感染，未發(fā)現(xiàn)有D型. 謝秀琴等5對江蘇地區(qū)128例乙肝患者分型研究結果顯示，該地區(qū)主要以C型（61.72%）和B型（37.5%）為主，僅發(fā)現(xiàn)1例B、C混合型（0.78%）. 由上可知，本研究對于江蘇地區(qū)乙肝患者HBV分型的結果與國內其他學者的結果基本一致，但是B, C混合型所占的比例較大、B型所占的比例較小，還存在有A型、D型感染，與以往的研究結果存在差異，這可能由

16、于樣本差異及實驗方法不同所致. 國內外眾多研究發(fā)現(xiàn)，HBV基因型與臨床表現(xiàn)、預后、治療應答    均有一定關系，不同基因型具有不同的致病性. 葛憲民等6和臺灣學者Kao等7的研究結果提示，隨著疾病嚴重程度的增加，C型所占的比例升高，而B型所占比例降低，C型與較為嚴重的肝臟疾病有關. 本研究表明，慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者主要為C型感染為主、其次為B, C混合型，B型很少. C基因型在慢性乙型肝炎患者中的所占比例（71.4%）比在急性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者中所占的比例較高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）. 目前認為，乙

17、肝發(fā)病機制是HBV病毒誘導的免疫反應，而血清中高滴度的HBV是乙肝發(fā)病的危險因素之一，HBV的復制狀態(tài)與其基因型之間有無關系存在爭議. Kao等8研究發(fā)現(xiàn)C基因型患者的HBV DNA水平明顯高于B型患者；謝琴秀等5和李朝霞等9的研究結果顯示B型, C型HBV DNA水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）. 而本研究顯示C型與B型（P>0.05）, B型與B, C混合型（P>0.05）在HBV DNA水平上沒有明顯差異，但C型與B, C混合型患者的HBV DNA水平有顯著差異（P<0.05），B, C混合型患者的HBV DNA數(shù)量明顯高于C型，表明B, C混合型患者體內HB

18、V處于較高復制水平，這可能也是導致B, C混合型乙肝患者的預后極差的原因之一. HBV DNA基因分型與HBV病毒復制、臨床演變及治療反應相關，每個地區(qū)的主要基因型以及HBV的基因型地理分布與HBV感染的地方流行性有關. 因此，HBV基因型正成為21世紀HBV研究的熱點，同時研究乙型肝炎患者HBV DNA的基因型對于了解病毒感染后形成的不同臨床表現(xiàn)以及對抗病毒藥物的治療效果亦具有重要的意義. 文獻報道，干擾素對B基因型的療效優(yōu)于C基因型10，而另有報道，拉米夫定對C基因型的遠期療效明顯優(yōu)于B基因型11，這對臨床合理用藥具有重要的指導意義. 隨著對基因分型方法學研究的不斷深入，基因型分

19、析將會對乙肝的診斷、抗病毒治療、預后判斷有著積極的作用.【參考文獻】1 魏來. 乙型肝炎病毒的基因型及臨床意義J. 傳染病信息,2003,16:84-86.2 中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學會和肝病學分會，病毒性肝炎防治方案J. 中華肝臟病雜志, 2000,8:324-329.3 肖揚,周岳進,王開鑒,等. 浙江溫州地區(qū)1020例乙型肝炎患者HBV基因分型研究J. 中西醫(yī)結合肝病雜志,2005,15(1):41-42.4 李雅娟,莊輝,李杰,等.  乙型肝炎病毒感染者病毒基因型和亞型分布及其臨床意義J. 中華肝臟病雜志,2005,13(10):724-729.5 謝秀琴,許家璋,李平,等. 江蘇地區(qū)乙型肝炎病毒基因分型及其臨床意義J. 疾病控制雜志,2005,9(2):171-173.6 葛憲民,李丹亞,方鐘燎,等.