巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及靶向性研究

1、巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及靶向性研究         【摘要】  目的: 構(gòu)建巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的靶向巨噬細(xì)胞的真核表達(dá)載體。方法: PCR方法合成巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子, 并將其插入帶有綠色熒光蛋白（GFP）基因的真核表達(dá)載體pEGFPN1中, 替代CMV啟動(dòng)子。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法, 將其與紅色熒光蛋白真核表達(dá)載體（pERFPN1）共轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞, 通過熒光顯微鏡觀察GFP和RFP在不同細(xì)胞中的表達(dá)水平來鑒定啟動(dòng)子的靶向性。結(jié)果: 成功構(gòu)建了巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的真

2、核表達(dá)載體, 并且能在巨噬細(xì)胞中高效特異性地表達(dá)報(bào)告基因。結(jié)論: 構(gòu)建的靶向巨噬細(xì)胞的真核表達(dá)載體能提高目的基因的表達(dá)特異性, 為提高基因治療胞內(nèi)菌感染的靶向性及降低毒副作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  巨噬細(xì)胞 細(xì)胞特異性 動(dòng)子 真核表達(dá)載體 胞內(nèi)菌感染 基因治療   胞內(nèi)菌感染的治療一直是臨床上棘手的問題之一。常見的胞內(nèi)感染細(xì)菌主要有結(jié)核桿菌、 傷寒沙門氏菌等。這些胞內(nèi)感染菌突破人體第一道防線后, 在體內(nèi)首先遇到巨噬細(xì)胞的吞噬和殺滅。然而在很多情況下巨噬細(xì)胞雖能吞噬這些細(xì)菌, 卻并不能徹底殺死它們, 反而變成了胞內(nèi)菌的庇護(hù)所1。另外, 由于大多數(shù)抗菌藥在細(xì)胞

3、內(nèi)的濃度低, 導(dǎo)致胞內(nèi)菌不能被有效殺滅, 而且胞內(nèi)菌感染的治療療程長,  容易導(dǎo)致毒副反應(yīng)的發(fā)生和耐藥性的出現(xiàn), 更使其治療困難。因此, 針對(duì)胞內(nèi)菌感染的治療, 新型抗菌藥物和治療方法的開發(fā)及應(yīng)用顯得尤其重要。我們前期成功構(gòu)建了抗菌肽基因的真核表達(dá)載體, 并在小鼠巨噬細(xì)RAW264.7中成功表達(dá)了抗菌肽, 發(fā)揮了殺滅胞內(nèi)菌的作用(待發(fā)表)。但是由于抗菌肽具有一定的毒副作用, 會(huì)對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用。為了減少抗菌肽對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞的毒副作用, 增強(qiáng)目的基因表達(dá)的特異性和基因治療的靶向性, 本研究中我們構(gòu)建了巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的靶向巨噬細(xì)胞的真核表達(dá)載體, 并利用綠色熒光蛋白（

4、GFP）和紅色熒光蛋白（RFP）作為報(bào)告基因研究了該啟動(dòng)子在不同種類細(xì)胞中表達(dá)的特異性。1  材料和方法1.1   材料 真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFPN1和pERFPN1為Clontech公司產(chǎn)品。大腸桿菌DH5由本室保存。高保真聚合酶、 逆轉(zhuǎn)錄酶、 連接酶、 DNA marker等購自大連TaKaRa公司。限制性內(nèi)切酶Vsp I和Kpn I購自上海生工生物有限公司。膠回收試劑盒、 質(zhì)粒提取和RNA提取試劑盒購自上海華舜公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。其他試劑為國產(chǎn)分析

5、純試劑。小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7、 人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo、 人肝癌細(xì)胞株HepG2、 人乳腺癌細(xì)胞株ZR7530、 非洲綠猴腎細(xì)胞株COS7均由本室保存。1.2  方法1.2.1  引物的設(shè)計(jì)與合成及巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的拼接合成  根據(jù)GenBank（登錄號(hào): DQ107382）和參考文獻(xiàn)報(bào)道的巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)拼接引物, 序列為P1:  5GGCGCATTAATAAGCGACTTCCTCTTTCCAGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCCAAGATTTCCAAACTCTGTGGTTGCCTTG3, P2:5ACGAGCTCCT

6、ACTTCTCCTTTTCTGCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTCAAGGCAACCACAGAGTTTGG3, P3: 5ACGAGCTCCTACTTCTCCTTTTCTGCCAAGATTTCCAAACTCTGTGGTTGCCTTG3, P4: 5CTTCTCCTTTTCTGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCAAGGCAACCACAGAGTTTG3, P5: 5CTTTTCTGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTTACCCTCCC3, P6: 5GAGGAAGTCGCTTTTGTCGCGGTCGG

7、GACAGGGGGCAGGGAGGGTAAAGCGACTTCC3, P7: 5GCGACAAAAGCGACTTCCTCTTTCCAGTGCATTTAAGGCGCAGCCTGGAAGTGCCAGG3, P8: 5GGGGTACCGCTAGCGACTGGGTGGCCTCCAGTGCTCCCTGGCACTTCCAGGCTGCG3。其中劃線處分別為為Vsp I和Kpn I的酶切位點(diǎn), 引物由上海生工生物有限公司合成。以P1和P8為引物, P2P7為模版通過PCR方法拼接合成巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列, 反應(yīng)條件如下: 98 10 s, 68 30 s, 共30個(gè)循環(huán); 72 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用10

8、g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.2.2  巨噬細(xì)胞啟動(dòng)子的克隆及測序鑒定  PCR產(chǎn)物電泳后經(jīng)膠回收試劑盒純化, 與真核表達(dá)載體pEGFPN1用Vsp I和Kpn I進(jìn)行雙酶切, 酶切片段回收后16連接過夜, 連接產(chǎn)物用氯化鈣方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5, 菌落PCR方法篩選陽性菌落, 提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定, 并送測序。測序正確的載體命名為pSPGFP。1.2.3  細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染  小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7、 人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo、 人肝癌細(xì)胞株HepG2、 人乳腺癌細(xì)胞株ZR7530、 非洲綠猴腎細(xì)胞株COS7用含有100 mL/L胎牛血清的RPM

9、I1640培養(yǎng)液, 在3750mL/LCO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d鋪24孔板, 次日將質(zhì)粒pSPGFP和pERFPN1按摩爾比11混合, 按轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的表達(dá)。2  結(jié)果2.1  結(jié)巨噬細(xì)胞啟動(dòng)子的拼接合成 通過拼接PCR方法合成了巨噬細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子序列,   片段大小為350 bp左右, 與理論預(yù)測大小相符（圖1）。2.2  巨噬細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體的構(gòu)建和酶切鑒定  PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后插入真核表達(dá)載體pEGFPN1, 替代CMV啟動(dòng)子得到重

10、組表達(dá)載體。對(duì)重組載體進(jìn)行Vsp I和Kpn I雙酶切鑒定, 得到1條約350 bp的DNA片段（圖2）, 與理論預(yù)測值一致。經(jīng)測序鑒定序列正確（測序圖略）, 命名為pSPGFP。2.3  轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞中GFP的表達(dá) 重組質(zhì)粒pSPGFP與內(nèi)參對(duì)照質(zhì)粒pERFPN1按等摩爾比共轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞株。作為內(nèi)參的報(bào)告基因RFP在各細(xì)胞株中均為高表達(dá)。GFP則僅在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中高表達(dá), 表達(dá)強(qiáng)度與RFP相近; 而在其他非巨噬細(xì)胞中, GFP幾乎沒有表達(dá)（圖3）。這說明我們構(gòu)建的巨噬細(xì)胞特異性載體能夠靶向巨噬細(xì)胞高效表達(dá)報(bào)告基因GFP。  

11、60;      3  討論   采用基因治療的方法來治療胞內(nèi)菌感染, 尤其是難治性胞內(nèi)菌感染, 是一種新型有效的治療策略。但是, 由于基因治療的載體往往缺乏靶向性, 當(dāng)載體進(jìn)入機(jī)體后表達(dá)的目的基因往往會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用, 造成機(jī)體損傷。所以, 基因治療的靶向性是決定基因治療成功與否的關(guān)鍵點(diǎn)之一, 也是目前基因治療的研究熱點(diǎn)。   巨噬細(xì)胞靶向性的基因表達(dá)的主要機(jī)制就是用巨噬細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子來啟動(dòng)目的基因的表達(dá), 使目的基因的表達(dá)僅限于巨噬細(xì)胞, 從而減輕其對(duì)正常組織細(xì)胞的損傷?，F(xiàn)已

12、廣泛應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化等3, 5, 6疾病的治療研究。   在本實(shí)驗(yàn)中, 我們合成了巨噬細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子序列, 并以之替代pEGFPN1載體的CMV啟動(dòng)子, 成功構(gòu)建了巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的真核表達(dá)載體pSPGFP。通過轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞和多種非巨噬細(xì)胞, 觀察GFP表達(dá)效率來驗(yàn)證該啟動(dòng)子的巨噬細(xì)胞靶向性。為了平衡各實(shí)驗(yàn)組間的細(xì)胞數(shù)、 細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率等因素的差異對(duì)GFP表達(dá)的影響, 本實(shí)驗(yàn)中我們利用表達(dá)紅色熒光蛋白的pERFPN1載體作為轉(zhuǎn)染的內(nèi)參照, 與重組載體共轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞, 通過比較GFP和RFP的表達(dá)差異來判斷啟動(dòng)子的表達(dá)特異性。此方法比單獨(dú)使用GFP7, 8更準(zhǔn)

13、確。而與利用海腎螢光素酶等作為內(nèi)參照的雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)相比, 該方法更簡變、 更直觀而且無需特殊的檢測儀器。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 以巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)的GFP可以在巨噬細(xì)胞中高效表達(dá), 在非巨噬細(xì)胞中則幾乎沒有表達(dá); 而以CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)的RFP在巨噬細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞中均有表達(dá)。這說明我們構(gòu)建的巨噬細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體可以在巨噬細(xì)胞中特異性的表達(dá)目的基因, 為靶向巨噬細(xì)胞的基因治療提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Leemans JC, Thepen T, Weijer S, et al. Macropahges play a dual role during pul

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