不同年齡大鼠顆粒性腦蛋白聚糖的比較研究

1、第24卷第2期2003年4月西安交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）Journal of Xi an Jiaoton g Universit y （Medical Sciences ）Vol. 24No. 2A p r. 2003不同年齡大鼠顆粒性腦蛋白聚糖的比較研究梁雪清，田夢玉（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室，陜西西安摘要：目的探討顆粒性腦蛋白聚糖（PG ）與腦發(fā)育和老化的關(guān)系。方法710061）純種SD 大鼠隨機分為3組：初生組、顆粒性腦青年組和近老年組。腦組織經(jīng)脫脂處理后，L -1鹽酸胍提取各組大鼠顆粒性腦PG ，4mol DEAE-Se p hacel 柱層析分離純化，雙向電泳法分析其糖胺多糖（GA

2、G ）的組成。結(jié)果Se p harose 4B 柱層析分析其分子大小，素蛋白聚糖（DSPG ）的比例隨增齡而增高，而小分子CSPG 的比例則隨增齡而降低。結(jié)論年齡的增長發(fā)生一定的變化，與腦的發(fā)育和老化密切相關(guān)。關(guān)鍵詞：腦蛋白聚糖；糖胺多糖；發(fā)育中圖分類號：R 654. 2文獻標識碼：A文章編號：（2003）1671-825902-0101-04大分子硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPG ）主要存在于初生組和青年組；小分子硫酸皮膚PG 的提取率隨增齡而降低；顆粒性腦PG 隨動物Com p arative stud y on p articulate brain p roteo g l y cans in

3、 rats of different a g esLian g Xue q in g ，Tian Men gy u（De p artment of Biochemistr y ，Medical School of Xi an Jiaoton g Universit y ，Xi an 710061，China ）ABSTRACT ：Ob j ective（PG ）with develo p ment To stud y the association of p articulate brain p roteo g l y canSD rats were divided into three g

4、rou p s ：new born ，y oun g adult and near oldL -1g rou p s. After brain tissues were defatted ，p articulate brain PGs of each g rou p were extracted with 4mol of g uanidine HCl and p urified b y DEAE-se p hacel chromato g ra p h y ，their molecular sizes were identified b y（GAG ）com p ositions were c

5、haracterized b y two Se p harose 4B chromato g ra p h y and their g l y cosamino g l y canThe extraction rates of p articulate brain PGs decreased with a g e ；thelar g e molecular-size p articulate CSPG mainl y existed in new born and y oun g adult g rou p s ；the p ercenta g e of small molecular-siz

6、e DSPG increased and CSPG declined with a g e. ConcIusion with a g e and are related to brain develo p ment and a g in g .Particulate brain PGs chan g edimensional electro p horesis. ResuItsand a g in g of the brain. MethodsKEY WORDS ：brain p roteo g l y can ；g l y cosamino g l y can ；develo p ment

7、腦組織中的蛋白聚糖（p roteo g l y can ，PG ）主要有硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPG ）、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG ）和硫酸皮膚素蛋白聚糖（DSPG ）等1，2類，其特點是易提取的可溶性腦PG 占的比例較大，而難提取分離的顆粒性腦PG 占的比例較小。近年來國外學(xué)者開始研究腦PG 與發(fā)育和老3化的關(guān)系，但研究對象多為可溶性腦PG ，且多選擇某一部位進行研究，難以反映全貌，也難以深入闡明顆粒性腦PG 與腦的發(fā)育和老化的關(guān)系。本研究在改進提取分離方法的基礎(chǔ)上，對大鼠顆粒性腦PG 進行提取和分離，同時對不同年齡組（初生組、青年組及近老年組）顆粒性腦PG 的分子特收稿日期：修回日期

8、：2002-08-082002-10-21基金項目：國家自然科學(xué)基金資助（No. 39070240）通訊作者：田夢玉. Tel ：（029）5275816作者簡介：梁雪清（1970-），女（漢族），博士/講師. 研究方向：基因診斷和治療. 現(xiàn)在廣州醫(yī)學(xué)院生化教研室（510182）Tel mail ：LXQ76hotmail. com點進行了比較分析，旨在對顆粒性腦PG 與發(fā)育年齡的關(guān)系有一個全面的了解，為今后進一步研究顆粒性腦PG 的分子與功能的關(guān)系提供線索。11. 1材料和方法酶和試劑鏈酶蛋白酶（E ，；鹽Merck 產(chǎn)品）酸胍（上海試劑總廠產(chǎn)品經(jīng)活性碳處理后再結(jié)

9、晶）；DEAE-Se p hacel 、Se p harose 4B （Pharmacia 產(chǎn)品）、硫酸乙酰肝素（HS ）、硫酸皮膚素硫酸軟骨素（CS ）（DS ）及透明質(zhì)酸（HA ）標準物為芝加哥大學(xué)Hor-witz 博士惠贈。1. 2動物處理將SD 純種大鼠按年齡分為3組：（生后1d ）；（34個月齡）；初生組青年組（15個月齡以上）。各組動物均于實驗近老年組前準確稱取體重，立即斷頭處死，剝離全腦，用冰冷的Tris-HCl （10mmol L -1，反復(fù)沖洗，除去p H 7. 2）卷附著在腦表面的血液，濾紙除去多余的緩沖液，分別準確稱重后進行勻漿和提取實驗。3大鼠腦經(jīng)準確稱重后，用1. 3

10、腦PG 的提?。╬ H 20倍體積的10mmol L -1Tris-HCl 緩沖液在冰浴下充分勻漿，其間4提取48h 以上，7. 2）表1分組初生組青年組近老年組大鼠顆粒性腦PG 的提取量n 801517（x ±s ）-351312己糖醛酸/g -1腦濕重提取率/%g180. 35±19. 00*39. 60±2. 2444. 41±1. 98不斷振蕩。經(jīng)離心后分為上清部分（內(nèi)含可溶性腦和沉淀顆粒部分（內(nèi)含細胞結(jié)合性腦PG ）。將PG ）沉淀顆粒部分經(jīng)丙酮及氯仿（V ）（V ）：/甲醇2:1脫脂處理后，加入4mol L -1鹽酸胍2mL ，4提注：與其他

11、兩組相比*P <0. 052. 2DEAE-Se p hacel 柱層析為了進一步得到純化的顆粒性腦PG ，將上述各提取物分別上DEAE-并用含0. 11mol L -1NaCl 的Se p hacel 層析柱，取48h 以上，其間不斷振蕩，進一步提取分離顆粒性腦PG 。在上述提取液中加入4倍體積的乙酸鈉飽和乙醇沉淀PG ，4放置過夜，離心，棄上清。再依次加入少量的無水乙醇和乙醚脫水干燥，得PG 的初提樣品。1. 4腦組織PG 的分離純化DEAE-Se p hacel柱層析5：將PG 樣品用58mL 7mol L -1尿素0. 1mol L -1NaCl ，50mmol L -1NaAC

12、 ）溶解，上DEAE-Se p hacel 柱（1×10cm ），用7mol L -1尿素（內(nèi)含0. 11mol L -1NaCl ，50mmol L -1NaAC ，p H6. 7）進行梯度洗脫，計時收集，流速為3mLh -1，每管收集1mL 。Se p harose 4B 柱層析6：將DEAE-Se p hacel 柱層析后所得的各峰值管樣品溶于1mL 1mol L -1鹽酸胍（內(nèi)含50mmol L -1Tris-HCl ，2mmol L -1Na 2-EDTA ，1mmolL -1的N-乙酰馬來酰亞胺和0. 2mmol L -1苯基甲磺酰胺，p H7. 5，下同）中，取0. 5

13、mL 上Se p harose 4B 柱（0. 8×100cm ），用1mol L -1鹽酸胍進行洗滌，計滴收集，每管收集30滴。層析洗脫收集液的監(jiān)測：采用阿爾新蘭染色斑點檢測法。將層析過程收集的各管，各取510µL 點在醋酸纖維素薄膜上，用0. 1nmol L -1阿爾新蘭液（內(nèi)含1mol L -1乙醇、0. 17nmolL -1乙酸及0. 03mol L -1氯化鎂）染色20min ，經(jīng)4次漂洗后，晾干。剪下各斑點，溶于1. 5mL 二甲亞砜（內(nèi)含0. 05mol L -1硫酸）中，37保溫30min ，不斷振搖，最后在677nm 下測定各斑點的吸光度。1. 5腦組織P

14、G 中糖胺多糖（GAG ）的雙向電泳按文獻6所述方法進行。2結(jié)果2. 1不同年齡腦PG 的提取顆粒性腦PG 的提取量，采用測定提取物中的己糖醛酸含量為指標。以己糖醛酸µg g -1腦濕重計4，不同年齡組顆粒性腦PG 的提取量和殘渣保留量以及由此計算的提取率列于表1。7molL -1尿素液進行梯度洗脫，用阿爾新蘭染色斑點法進行監(jiān)測。3組顆粒性部分均可得到一個大的腦PG 洗脫峰。初生組和青年組均分布于0. 76molL -1NaCl 附近，而近老年組則分布于0. 64molL -1NaCl 附近，提示在近老年組，其顆粒性腦PG 分子中的負電荷量低于初生組和青年組。另外，青年組在0. 5m

15、ol L -1NaCl 附近還有一個較小的洗脫峰，近老年組依次在0. 33mol L -1Na-Cl 和0. 5molL -1NaCl 附近有兩個較小的洗脫峰。經(jīng)測定，這3個洗脫峰的蛋白質(zhì)比例均在90%以上，可能是糖蛋白的洗脫峰（圖1） 。（內(nèi)含2期梁雪清，田夢玉. 不同年齡大鼠顆粒性腦蛋白聚糖的比較研究103水解液先用高濃度的NaCl 溶解，用3mol L -1乙并加熱煮沸以沉淀除去其中的蛋酸調(diào)節(jié)至p H 5，白質(zhì)，經(jīng)離心后，所得上清用乙酸鈉飽和乙醇沉淀其中的GAG ，經(jīng)用無水乙醇及乙醚洗滌后得到干燥的GAG 樣品。用適量的0. 6mol L -1NaCl 溶解GAG 樣品，然后點樣進行雙向

16、電泳。電泳后薄膜上各染色斑點GAG 的種類用標準物共電泳的方法加以確定（圖3），然后將各斑點剪下，溶于二甲亞砜（內(nèi)含0. 05mol L -1硫酸）中，測定其677比例也有隨年齡的增長而下降的趨勢。表2顆粒性腦PG 經(jīng)Se p harose 4B 柱層析后的GAG 組成（%）分組初生組青年組近老年組初生組青年組GAGCS 10084838889HA -1617-11HS -12-DS -組分nm 下的光吸收，進而計算出各種GAG 的百分含量，所得結(jié)果見表2 。圖3峰GAG 的醋酸纖維素薄膜雙向電泳由圖3可見，在顆粒性腦PG 中，不僅含有硫酸軟骨素（CS ）、透明質(zhì)酸（HA ）和硫酸乙酰肝素HS

17、 ），而且還含有硫酸皮膚素（DS ），它們分布在分子大小不同的PG 洗脫峰中，表明在腦組織中不僅含有CSPG 和HSPG ，而且還含有DSPG ，甚至還含有兩種GAG 糖鏈的雜化型PG 。由表2可見，CS 主要存在于分子比較大的峰和峰，而且與HA 共存，表明是大分子集聚型的CSPG ；HSPG 主要存在于分子比較小的峰中，有的在峰中也有少量；而DSPG 則主要存在于小分子的峰中，有的在峰也有少量。GAG 的年齡性變化最明顯的是峰，它的DS 的比例隨年齡增長而逐漸增高，而CS 的比例則隨年齡增長而下降。此外，峰的CS 近老年組77914-初生組77-1013青年組69-2011近老年組77-71

18、6初生組61-39青年組58-42近老年組37-633討論3. 1顆粒性腦PG 分子電荷的年齡性差異PG是一種具有負電荷的生物大分子，應(yīng)用離子交換柱層析分析純化PG ，主要是根據(jù)其負電荷的性質(zhì)進行的。本研究在應(yīng)用DEAE-Se p hacel 柱層析分離純化腦PG 時，發(fā)現(xiàn)3組顆粒性部分均可獲得一個腦PG 洗脫峰。但在近老年組，其腦PG 的梯度洗脫峰位置出現(xiàn)了明顯前移現(xiàn)象，提示近老年組腦PG 分子的負電荷量明顯低于其他各組。PG 的負電荷減少是組織老化的一種表現(xiàn)，這在軟骨CSPG 的研究中已得到證實。但其機理尚不清楚，可能是由于催化轉(zhuǎn)錄后糖基化和硫酸化的酶類活性發(fā)生改變，致使糖鏈和硫酸化程度有

19、所降低。我們曾分析了3種腦PG 的己糖醛酸/蛋白質(zhì)比例，發(fā)現(xiàn)近老年組均低于其他兩組，這可能是其負電荷降低的一個因素。要完全明確顆粒性腦PG 負電荷降低的原因，需進一步分析其GAG 糖鏈的特點，包括糖鏈的組成、分子大小以及硫酸化的程度等。3. 2顆粒性腦PG 的分子大小和種類及其年齡性差異3組顆粒性腦PG 經(jīng)過Se p harose 4B 柱層析后，可按分子質(zhì)量大小分為4部分，即峰、峰、峰、峰。峰是屬于大分子的CSPG ；峰主要也是CSPG ，但分子質(zhì)量略?。环逡訦SPG 為主；峰以小分子DSPG 為主，但尚不能排除既含DS 鏈又含CS 鏈的雜化型小分子PG 。此外，CS 在4個峰中均含有一定比

20、例，表明腦中的CSPG 可能存在著幾種分子大小不同的類型。由于在提取分離的各個階段均應(yīng)用了各種蛋白酶抑制劑，故可排除核心蛋白水解的可能性。Mar g olis 等總結(jié)了國（104西安交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）第24卷外不同學(xué)者從腦組織中鑒定的約10余種CSPG ，其相對分子質(zhì)量范圍相當大，從6070kD 到5。由此可見，存在于腦組織中的PG ，680kD 不等不僅種類較多，而且同一種類型的PG 也還有不同CS 比例則逐漸下降。綜上所述，顆粒性腦PG 隨動物年齡的增長發(fā)生一定的變化，與腦的發(fā)育和老化有密切關(guān)系。本研究為進一步探討腦PG 的結(jié)構(gòu)、功能及其在發(fā)育和老化中的變化機理提供了較為重要的線索和依

21、據(jù)。參考文獻：1Sobel RA ，Ahmed AS. White matter extracellular matrixchondroitin sulfate 7dermatan sulfate 8roteo 9l :cans in multi; （12）：. <=euro8athol >x8=eurol，2001，608le sclerosis <1198-1207.2?hun 9A，Beun 9C，Bin B ，et al . De 8aran sulfate 8roteo;. 9l :can ex 8ression in the o 8tic chiasm of mo

22、use embr :os <（2）： x;1986，62：347-362. 8l ?ell Res ，6?alson SS. S :na 8tic Gesicle 9l :co 8roteins and 8roteo 9l :cans in. =eJAorH ：Flenum neurobiolo 9:of 9l :cocon I u 9ates C Fress ，1989. 309-336.（編輯卓選鵬）的分子類型。進一步研究這些復(fù)雜多樣PG 的分子特點以及它們的功能，可能具有重要意義。3組顆粒性腦PG 的年齡性差異比較明顯的主要有以下幾個方面：從各洗脫峰的分布比例來看，初生組和青年組大部分集中于大分子的峰，分別為53%和73%；而中等分子和低分子洗脫峰的比例都比較小。與此相反，近老年組的峰比例最小，為17%，而峰的比例卻較其他兩組約高2倍以上，峰和峰也高