大鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞TREG酶聯(lián)免疫分析

1、大鼠調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞 (TREG) 酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用。檢測(cè)范圍：96T3.5pg/ml-160pg/ml使用目的：本試劑盒用于測(cè)定大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞 (TREG) 含量。實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞 (TREG) 水平。用純化的大鼠調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (TREG) 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (TREG) ，再與 HRP 標(biāo)記的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (TREG) 抗體結(jié)合， 形成抗體 -抗原 -酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB 顯色。 TMB 在 HRP 酶

2、的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞 (TREG) 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（ OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(TREG) 濃度。試劑盒組成130 倍濃縮洗滌液20ml× 1 瓶7終止液6ml ×1 瓶2酶標(biāo)試劑6ml × 1 瓶8標(biāo)準(zhǔn)品（ 240pg/ml ）0.5ml × 1 瓶3酶標(biāo)包被板12孔× 8條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml × 1 瓶4樣品稀釋液6ml × 1 瓶10說明書1 份5顯色劑 A液6ml × 1

3、瓶11封板膜2 張6顯色劑 B液6ml × 1/瓶12密封袋1 個(gè)標(biāo)本要求1標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融2不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋： 本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支， 用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。120pg/ml5 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150l 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液60pg/ml4 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150l 的 5 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液30pg/ml3 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150l 的 4 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入15

4、0l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液15pg/ml2 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150l 的 3 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液7.5pg/ml1 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150l 的 2 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2.加樣： 分別設(shè)空白孔 （空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同） 、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50l，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40l，然后再加待測(cè)樣品 10l（樣品最終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3.溫育：用封板膜封板后置37溫育 30 分鐘。4.配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩

5、干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50l，空白孔除外。7. 溫育：操作同 3。8. 洗滌：操作同 5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 l，再加入顯色劑 B50l，輕輕震蕩混勻， 37避光顯色10 分鐘.10. 終止：每孔加終止液 50l，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色） 。11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。操作程序總結(jié)：OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止計(jì)算OD以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)

6、準(zhǔn)物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式， 計(jì)算出樣品濃度， 再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。注意事項(xiàng)1試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。3各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（× n× 5）。5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6底物請(qǐng)避光保存。7嚴(yán)格按