第六章 微生物遺傳變異

1、第六章第六章 微生物的遺傳變微生物的遺傳變異與菌種選育異與菌種選育幾個基本概念 遺傳型遺傳型(genotype): 又又稱基因型，指某一稱基因型，指某一生物個體所含有的生物個體所含有的全部遺傳因子即基全部遺傳因子即基因的總和。因的總和。 表現(xiàn)型表現(xiàn)型(phenotype): 指某一生物所具有指某一生物所具有的一切外表特征及的一切外表特征及內在特性的總和，內在特性的總和，是遺傳型在合適條是遺傳型在合適條件下的具體體現(xiàn)。件下的具體體現(xiàn)。遺傳型遺傳型 + 環(huán)境條件環(huán)境條件代謝代謝發(fā)育發(fā)育 表型表型幾個基本概念 變異變異(variation):指生物體在某種外指生物體在某種外因或內因作用下引因或內因作

2、用下引起的遺傳物質結構起的遺傳物質結構或數(shù)量的改變，亦或數(shù)量的改變，亦即遺傳型的改變。即遺傳型的改變。 飾變飾變(modification): 指不涉及遺傳物質指不涉及遺傳物質結構改變而只發(fā)生結構改變而只發(fā)生在轉錄、轉譯水平在轉錄、轉譯水平上的表型變化。上的表型變化。 遺傳遺傳( (heredity或或inheritance) )和變異和變異( (variation) )是生物體最是生物體最本質的屬性之一。本質的屬性之一。 在遺傳性適宜的環(huán)境條件下時，在遺傳性適宜的環(huán)境條件下時，通過代謝和發(fā)育才能使其后代轉通過代謝和發(fā)育才能使其后代轉化為與親代相同的具體性狀?；癁榕c親代相同的具體性狀。 本章主

3、要內容 一、證明核酸是遺傳變異物質基礎的經一、證明核酸是遺傳變異物質基礎的經典實驗典實驗 肺炎雙球菌的轉化實驗肺炎雙球菌的轉化實驗 噬菌體的感染實驗噬菌體的感染實驗 煙草花葉病毒的拆開與重組實驗煙草花葉病毒的拆開與重組實驗 這些實驗說明： 加熱殺死的S型細菌，在其細胞內可能存在一種轉化物質， 這種轉化物質能通過某種方式進入R型細胞，并使得R型細胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀。以上結果表明 只有S型菌株的DNA才能將S.pmeumoniae 的R型轉化成S型。 DNA純度越高，轉化效率也越高。 轉移的是以DNA為物質基礎的遺傳因子，而不是遺傳性狀本身（莢膜多糖）。（二）（二）噬菌體的感染實驗噬菌體的感染實

4、驗 1952 1952 年，侯喜年，侯喜( (A. Hershey)A. Hershey)和蔡斯和蔡斯( (M. Chase)M. Chase)發(fā)表了證發(fā)表了證明明DNADNA是噬菌體的遺傳物質的實驗：是噬菌體的遺傳物質的實驗： 先用含有放射性先用含有放射性3535SOSO4 42-2- 或或 3232POPO4 43-3- 的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，然后讓菌，然后讓 T2 T2 噬菌體侵染培養(yǎng)后的大腸桿菌，從而使噬菌體侵染培養(yǎng)后的大腸桿菌，從而使 T2 T2 噬菌體打上噬菌體打上 3535S S 或或 3232P P 的標記。的標記。 讓這種讓這種 T2 T2 噬菌體侵染不含標

5、記元素的大腸桿菌噬菌體侵染不含標記元素的大腸桿菌 吸附和侵入后，吸附和侵入后， 強烈攪拌洗滌，再進行離心沉淀，分別強烈攪拌洗滌，再進行離心沉淀，分別測定沉淀物和上清液中的同位素標記。測定沉淀物和上清液中的同位素標記。 結果發(fā)現(xiàn)，幾乎全部結果發(fā)現(xiàn)，幾乎全部 3535S S 都在上清液中，而幾乎全部都在上清液中，而幾乎全部 3232P P 和細菌一起出現(xiàn)在沉淀物中。和細菌一起出現(xiàn)在沉淀物中。 The Hershey-Chase experiment（三）（三）煙草花葉病毒的拆開與重組實驗煙草花葉病毒的拆開與重組實驗 1956年，美國的法朗克-康勒特(Fraenkel-Conrat) 將煙草花葉病毒

6、拆成RNA和蛋白質，并分別對煙草進行感染實驗； 結果發(fā)現(xiàn)只有RNA能感染煙草，并在感染后的寄主中分離到完整的具蛋白質外殼的煙草花葉病毒。 后來他又將甲、乙兩種變種的煙草花葉病毒拆開，在體外分別將甲病毒的 RNA和乙病毒的蛋白質結合，將乙病毒的RNA 和甲病毒的蛋白質結合進行重組。 接著他把這些經過重組的病毒分別感染煙草。結果從寄主分離所得的病毒蛋白質均取決于相應病毒的 RNA。證明了核酸(RNA)是煙草花葉病毒的遺傳物質基礎。（三）煙草花葉病毒的拆開與重組實（三）煙草花葉病毒的拆開與重組實驗驗 霍氏車前花葉霍氏車前花葉病毒病毒拆開的病毒拆開的病毒雜合的病毒雜合的病毒罹病的煙葉罹病的煙葉重新分離

7、的病毒重新分離的病毒TMV重建實驗示意圖重建實驗示意圖TMVHRV煙草花葉病毒感染分離純化重建原始病毒 二、DNA的結構與復制 （一）（一）DNA的結構：的結構： DNA單體：核苷酸單體：核苷酸磷酸磷酸+核糖核糖+堿基堿基 A（腺嘌呤）（腺嘌呤） T（胸腺嘧啶）（胸腺嘧啶） C （胞嘧啶）（胞嘧啶）G（鳥嘌呤）（鳥嘌呤） 兩條核苷酸鏈兩條核苷酸鏈 多聚核苷酸多聚核苷酸 堿基在內堿基在內兩鏈上堿基互補配對兩鏈上堿基互補配對 （氫鍵相連）（氫鍵相連） AT GC 脫氧核糖、磷酸向外脫氧核糖、磷酸向外 Three representations of DNA. （一）（一）細胞水平細胞水平細胞核細胞

8、核；在細胞質中存在著一些能自我復制的遺傳物質，一般稱在細胞質中存在著一些能自我復制的遺傳物質，一般稱這部分這部分DNA DNA 為為質粒質粒。 （二）（二）細胞核水平細胞核水平 真核微生物的細胞核有核膜包圍，形成具有完整真核微生物的細胞核有核膜包圍，形成具有完整形態(tài)、在光學顯微鏡下清晰可見的細胞核，核內形態(tài)、在光學顯微鏡下清晰可見的細胞核，核內DNA DNA 與組蛋白結合在一起構成染色體。與組蛋白結合在一起構成染色體。 原核生物的原核生物的DNADNA與很少量蛋白質結合，沒有核膜包與很少量蛋白質結合，沒有核膜包圍，由圍，由DNADNA細絲構成環(huán)狀染色體。細絲構成環(huán)狀染色體。 （三）分子水平（三

9、）分子水平 DNADNA（ RNA RNA）在在DNA DNA 大分子上存在著決定某些遺大分子上存在著決定某些遺傳性狀的特定區(qū)段，即所謂基因傳性狀的特定區(qū)段，即所謂基因一個基因含若一個基因含若干核苷酸堿基組成的三聯(lián)密碼。干核苷酸堿基組成的三聯(lián)密碼。 四種核苷酸，按其排列組合方式的不同，可編出三聯(lián)四種核苷酸，按其排列組合方式的不同，可編出三聯(lián)密碼密碼 4 43 36464個，用于決定組成蛋白質的個，用于決定組成蛋白質的20 20 種氨基酸種氨基酸順序。起始密碼（順序。起始密碼（AUGAUG）和終止密碼（和終止密碼（UAAUAA、UGAUGA和和UAGUAG）。）。 2、基因、基因 在生物體內，一

10、切具有自主復制能力的遺傳功能單位，都可稱為基因。 其物質基礎是一個具有特定核苷酸順序的核酸片斷，每個基因一般含有1000bp(堿基對)。基因調基因調控系統(tǒng)控系統(tǒng)操縱子操縱子調節(jié)基因調節(jié)基因啟動基因啟動基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因酶及結酶及結構蛋白構蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白原核生物的基因通過組成以下的調控原核生物的基因通過組成以下的調控系統(tǒng)而發(fā)揮作用：系統(tǒng)而發(fā)揮作用：大腸桿菌乳糖操縱子大腸桿菌乳糖操縱子莫諾與雅可布因提出“操縱子學說”而榮獲1965年諾貝爾生理學與醫(yī)學獎 。1969年，貝克維斯（JRBeckwith）從大腸桿菌的DNA中分離出乳糖操縱子，完全證實了雅可布和莫諾的模型 。乳糖操

11、縱子關閉原核生物的質粒原核生物的質粒 游離于原核生物染色體外，具有獨立復游離于原核生物染色體外，具有獨立復制能力的小型共價閉合環(huán)狀制能力的小型共價閉合環(huán)狀DNA分子，分子，稱為質粒，即稱為質粒，即 cccDNA (circular covalently closed DNA)。幾種細菌的質粒幾種細菌的質粒 F因子因子（fertility factor）：又稱致育）：又稱致育因子或性因子。是因子或性因子。是E.Coli等細菌中決定等細菌中決定性別的質粒。性別的質粒。 R因子因子（resistance factor）: 又稱又稱R質粒，即抗抗生素或化學治療劑因子。質粒，即抗抗生素或化學治療劑因子。

12、 R因子對多種抗生素有抗性，可作篩選時因子對多種抗生素有抗性，可作篩選時的理想標記，也可用作基因載體。的理想標記，也可用作基因載體。 Col因子因子（colicinogenic factor）：）：即產大腸桿菌素因子。許多細菌都能產即產大腸桿菌素因子。許多細菌都能產生使其他原核生物致死的蛋白質類細菌生使其他原核生物致死的蛋白質類細菌毒素。大腸桿菌素（毒素。大腸桿菌素（colicin）具有通過）具有通過抑制復制、轉錄、轉譯或能量代謝等而抑制復制、轉錄、轉譯或能量代謝等而專一地殺死其他腸道細菌的功能。專一地殺死其他腸道細菌的功能。 Ti質粒質粒(tumor inducing plasmid)：即誘

13、癌質粒。即誘癌質粒。 巨大質粒巨大質粒(mega plasmid)：在根瘤菌：在根瘤菌屬中發(fā)現(xiàn)的一種質粒，其上有一系列固屬中發(fā)現(xiàn)的一種質粒，其上有一系列固氮基因。氮基因。 降解性質粒降解性質粒: 只在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。只在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。它們的降解性質粒可為一系列能降解復它們的降解性質?？蔀橐幌盗心芙到鈴碗s物質的酶編碼，從而能利用一般細菌雜物質的酶編碼，從而能利用一般細菌所難以分解的物質作碳源。所難以分解的物質作碳源。3、遺傳信息的傳遞 中心法則4.DNA的復制三、DNA的變性和復性 當天然雙鏈當天然雙鏈DNA受熱受熱或在或在其他因素其他因素的作用下，的作用下，兩條鏈之間的結合力被破壞而分開

14、成單鏈兩條鏈之間的結合力被破壞而分開成單鏈DNA，稱為，稱為DNA變性。變性。 其他因素：其他因素：pH，達，達11.3時，氫鍵完全消失時，氫鍵完全消失尿素尿素硫胺硫胺三、DNA的變性和復性 退火：退火：變性變性DNA溶液經適當處理后重新形成溶液經適當處理后重新形成天然天然DNA的過程叫退火。的過程叫退火。四、RNA 堿基四種：堿基四種： RNA有四種：有四種：RNARNA RNA反義反義RNA，是在，是在 RNA轉錄的同時形成的短的片轉錄的同時形成的短的片段，起調節(jié)作用，決定段，起調節(jié)作用，決定 RNA翻譯合成速率。翻譯合成速率。年美國科學家研究質粒的復制時發(fā)現(xiàn)了反義RNA。五、遺傳密碼六、

15、蛋白質的合成 蛋白質合成過程：蛋白質合成過程：轉錄轉錄翻譯翻譯多肽鏈形成多肽鏈形成 突變率突變率（mutation ratemutation rate）：）： 每一個細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾每一個細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率，稱突變率。率，稱突變率。 突變率為突變率為1010-8-8的，即指該細胞在一億次細胞分裂中，的，即指該細胞在一億次細胞分裂中，會發(fā)生一次突變。會發(fā)生一次突變。 或者一個含有或者一個含有10108 8個細胞的群體，當其分裂為個細胞的群體，當其分裂為2 210108 8個個細胞時，即可平均發(fā)生一次突變的突變幾率也是細胞時，即可平均發(fā)生一次突變的突變幾率也

16、是1010-8-8。 基因突變簡稱突變，是變異的一種，指生物體內遺傳物質的分子結構突然發(fā)生可遺傳的變化。紫外輻射誘變機制紫外輻射誘變機制 DNA強烈吸收紫外輻射后引起強烈吸收紫外輻射后引起DNA結構變化，結構變化，其變化形式有：其變化形式有：DNA鏈的斷裂鏈的斷裂DNA分子內和分子間的交聯(lián)，分子內和分子間的交聯(lián)，核酸與蛋白質的交聯(lián)核酸與蛋白質的交聯(lián)胞嘧啶和鳥嘌呤的水合作用胞嘧啶和鳥嘌呤的水合作用胸腺嘧啶二聚體的形成胸腺嘧啶二聚體的形成微生物能以多種方式去修復被紫外線微生物能以多種方式去修復被紫外線損傷后的損傷后的 DNA，主要方式有兩種：主要方式有兩種： （1 1）光復活作用。）光復活作用。

17、光復活：細菌中的光復活：細菌中的DNA光解酶光解酶(photolyase)完成完成 特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價結合特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價結合的二聚體，并與其結合；的二聚體，并與其結合； 結合后如受結合后如受300600nm波長的光照射，則此酶就波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體分解為兩個正常的嘧啶單體，然后被激活，將二聚體分解為兩個正常的嘧啶單體，然后酶從酶從DNA鏈上釋放，鏈上釋放，DNA恢復正常結構?；謴驼＝Y構。 （2） 暗修復作用。也稱切除修復作用。暗修復作用。也稱切除修復作用。T T胸腺嘧啶二聚體胸腺嘧啶二聚體 切除修復有四種酶的參與：切除修復

18、有四種酶的參與：內切酶內切酶外切酶外切酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA連接酶連接酶 DNA損傷修復的其他方式損傷修復的其他方式 重組修復 修復 適應性修復定向培育和馴化 定向培育定向培育是人為利用一特定環(huán)境條件長是人為利用一特定環(huán)境條件長期處理某一微生物群體，同時不斷將它期處理某一微生物群體，同時不斷將它們進行移種傳代，以達到累積和選擇合們進行移種傳代，以達到累積和選擇合適的自發(fā)突變體的一種古老的育種方法。適的自發(fā)突變體的一種古老的育種方法。 環(huán)境工程中稱馴化環(huán)境工程中稱馴化 基因重組又稱為遺傳重組，它是指把兩個不同基因重組又稱為遺傳重組，它是指把兩個不同性狀個體內的遺傳基因轉移到一起，

19、經過遺傳性狀個體內的遺傳基因轉移到一起，經過遺傳分子的重新組合后，形成新遺傳型個體的過程。分子的重新組合后，形成新遺傳型個體的過程。 真核微生物中的有性雜交，準性生殖真核微生物中的有性雜交，準性生殖以及以及原核原核微生物中的轉化、轉導、接合和溶原轉變微生物中的轉化、轉導、接合和溶原轉變等都等都是基因重組在細胞水平上的反映。是基因重組在細胞水平上的反映。 受體菌直接吸收來自供體菌的受體菌直接吸收來自供體菌的DNA DNA 片段，通過交換組合把它整片段，通過交換組合把它整合到自己的基因組中，從而獲得合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌的部分遺傳性狀的現(xiàn)象，了供體菌的部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉化。稱

20、為轉化。 只有處于只有處于感受態(tài)感受態(tài)的細菌才能接受的細菌才能接受轉化因子，進行轉化作用。轉化因子，進行轉化作用。 受體細胞的感受受體細胞的感受態(tài)態(tài)(competence)(competence)感受態(tài)因子是感受態(tài)因子是一種胞外蛋白一種胞外蛋白轉化過程的幾個階段： 雙鏈DNA片段與感受態(tài)受體菌細胞表面特定位點結合 DNA被分解成片段 DNA雙鏈中的一條單鏈被切除，另一條單鏈進入細胞 供體單鏈DNA片段與受體細胞核染色體組的同源區(qū)段配對，受體染色體組上的相應單鏈片段被切除，并被外來的單鏈DNA交換、整合和取代，形成雜合區(qū)段 受體菌的染色體組進行復制 細胞分裂后形成轉化子 1普遍性轉導普遍性轉導

21、由缺陷型噬菌體誤包（而非整合）供體由缺陷型噬菌體誤包（而非整合）供體細菌細菌DNA 中的任何一部分片段（包括核外遺傳物質在內）中的任何一部分片段（包括核外遺傳物質在內）后，當它再次感染受體細菌時，使后者獲得了這部分遺傳后，當它再次感染受體細菌時，使后者獲得了這部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為普遍性轉導。它的轉導頻率為性狀的現(xiàn)象，稱為普遍性轉導。它的轉導頻率為10-510-8。 2局限性轉導局限性轉導 由溫和噬菌體侵染而形成的某一溶源細由溫和噬菌體侵染而形成的某一溶源細菌群被誘導裂解時，其中極少數(shù)個體的菌群被誘導裂解時，其中極少數(shù)個體的DNA 可能與噬菌可能與噬菌體體DNA 發(fā)生若干特定基因的交換，從而

22、被整合到噬菌體發(fā)生若干特定基因的交換，從而被整合到噬菌體的基因組上，當該噬菌體再次感染受體細菌時，就使受體的基因組上，當該噬菌體再次感染受體細菌時，就使受體細菌獲得了這一特定遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為局限性轉導，細菌獲得了這一特定遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為局限性轉導，它的轉導頻率為它的轉導頻率為10-4 10-6。 通過供體細菌和受體細菌完整細胞間的直接接通過供體細菌和受體細菌完整細胞間的直接接觸而傳遞大段觸而傳遞大段DNA DNA 的過程，稱為接合（有時也稱的過程，稱為接合（有時也稱雜交）。雜交）。 在細菌中，接合現(xiàn)象研究最清楚的是大腸桿菌。在細菌中，接合現(xiàn)象研究最清楚的是大腸桿菌。發(fā)現(xiàn)能夠進行接合現(xiàn)象

23、的大腸桿菌有發(fā)現(xiàn)能夠進行接合現(xiàn)象的大腸桿菌有雄性雄性與與雌性雌性之分，而決定它們性別的是由是否存在之分，而決定它們性別的是由是否存在 F F 因子因子所決定。所決定。 F F因子又稱致育因子，是一種質粒，分子量為因子又稱致育因子，是一種質粒，分子量為 5 510107 7 道爾頓。道爾頓。 雌性細菌不含雌性細菌不含F(xiàn) 因子，稱為因子，稱為F - - 菌株，菌株， 雄性細菌含有游離存在的雄性細菌含有游離存在的F 因子，稱為因子，稱為F + + 菌菌株，株， 當雄性細菌細胞中所含的當雄性細菌細胞中所含的F 因子被整合在細胞因子被整合在細胞核的核的DNA 上，不呈游離狀態(tài)存在稱為上，不呈游離狀態(tài)存在

24、稱為Hfr 菌菌株（高頻重組菌株）；株（高頻重組菌株）； 有時被整合在細胞核有時被整合在細胞核DNA 上的上的F 因子，從因子，從DNADNA上面脫落下來，呈游離存在，但在脫落時，上面脫落下來，呈游離存在，但在脫落時，F(xiàn) 因子有時能帶一小段細胞核因子有時能帶一小段細胞核 DNA。我們將這我們將這種含有游離存在的但又帶有一小段細胞核種含有游離存在的但又帶有一小段細胞核DNA 的的F 因子的細菌稱為因子的細菌稱為 F菌株。菌株。 是細菌通過性菌毛相互連接溝通，將遺傳物質（主要是質粒DNA）從供體菌轉移給受體菌。（四）原生質體融合（四）原生質體融合 通過人為方法，使遺傳性狀不同的兩細通過人為方法，使

25、遺傳性狀不同的兩細胞的原生質體發(fā)生融合，并產生重組子胞的原生質體發(fā)生融合，并產生重組子的過程，稱為原生質體融合或細胞融合。的過程，稱為原生質體融合或細胞融合。 先準備兩個有選擇性遺傳標記的突變株，在高滲先準備兩個有選擇性遺傳標記的突變株，在高滲溶液中，用適當?shù)拿摫诿溉芤褐?，用適當?shù)拿摫诿? (如細菌可用溶菌酶或如細菌可用溶菌酶或青霉素處理，放線菌可用溶菌酶或相應的脫壁酶，青霉素處理，放線菌可用溶菌酶或相應的脫壁酶，真菌可用蝸牛酶或相應的脫壁酶等真菌可用蝸牛酶或相應的脫壁酶等) )去除細胞壁，去除細胞壁，再將形成的原生質體離心聚集，并加入促融合劑再將形成的原生質體離心聚集，并加入促融合劑PEG(

26、PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )促進融合，然后在高滲溶液中稀促進融合，然后在高滲溶液中稀釋，涂在能使其再生細胞壁釋，涂在能使其再生細胞壁 或進行分裂的培養(yǎng)或進行分裂的培養(yǎng)基上，待形成菌落后，通過影印接種法，將其接基上，待形成菌落后，通過影印接種法，將其接種到各種選擇性培養(yǎng)基上，最后鑒定它們是否是種到各種選擇性培養(yǎng)基上，最后鑒定它們是否是重組子重組子 形成菌落（五）溶源性轉變（五）溶源性轉變 一、菌種的退化與復壯 變異是隨機的：正變、負變 菌種退化是指群體中退化細胞占一定數(shù)量后表現(xiàn)出的菌種性能下降。 為了使微生物的優(yōu)良性狀持久延續(xù)下去，必須做好復壯工作： 在菌種的性狀沒有發(fā)生退化之前，定期進行純種

27、分離和性能檢測。 菌種復壯的方法： （一）純種分離稀釋平板法、平板劃線法等顯微操作將生長良好的單細胞或單孢子分離出來 （二）通過寄主進行復壯適用于寄生性微生物，接種到相應寄主體內可以提高菌株對宿主的感染力。 （三）淘汰已衰退個體如用低溫處理 streptomyces microflows “5406”抗生菌的分生孢子采用-10-30低溫處理5-7天，使其死亡率達到80%，保留存活個體達到復壯目的。二、菌種的保藏 首先要挑選典型菌種的優(yōu)良純種，最好采用它們的休眠體（分生孢子、芽孢等）； 創(chuàng)造一個適合長期休眠的環(huán)境條件：干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)劑添加保護劑或酸度中和劑等。我國一般采用三種保

28、藏法： 固體培養(yǎng)基斜面上定期移植法（5以下保藏） 石蠟油封藏法（室溫下） 冷凍干燥保藏法（10以下保藏） 放線菌：砂土保藏法 絲狀真菌：麩皮保藏法兩種最有效方法：冷凍干燥法：保藏期達515年液氮保藏法：20年以上 在基因水平上的遺傳工程，它用人為的方在基因水平上的遺傳工程，它用人為的方法將所需的某一供體生物的遺傳物質法將所需的某一供體生物的遺傳物質-DNADNA大分子提取出來，在離體的條件下用大分子提取出來，在離體的條件下用適當?shù)墓ぞ呙高M行切割后，把它與作為載適當?shù)墓ぞ呙高M行切割后，把它與作為載體的體的DNADNA分子連接起來，然后與載體一起分子連接起來，然后與載體一起導入某一更易生長、繁殖的

29、受體細胞中，導入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源遺傳物質在其中進行正常的復制以讓外源遺傳物質在其中進行正常的復制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新的育和表達，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術。種技術。 目的基因（即外源基因或供體基因）的目的基因（即外源基因或供體基因）的取得取得 載體系統(tǒng)的選擇載體系統(tǒng)的選擇 目的基因與載體重組體的構建目的基因與載體重組體的構建 重組載體導入受體細胞重組載體導入受體細胞 工程菌或工程細胞株的表達、檢測以及工程菌或工程細胞株的表達、檢測以及實驗室和一系列生產性試驗等實驗室和一系列生產性試驗等基因工程菌株的構建基因工程菌株的構建 1 1提取目的基因提取目的基

30、因 用密度梯度離心方用密度梯度離心方法分別從供體細胞中提取所需要的法分別從供體細胞中提取所需要的DNADNA即即目的基因和作為載體的細菌質?；蚴删康幕蚝妥鳛檩d體的細菌質?；蚴删w核酸，目的基因也可通過化學方法人體核酸，目的基因也可通過化學方法人工合成。工合成。 2 2處理目的基因處理目的基因 根據(jù)基因工程的根據(jù)基因工程的“設計藍設計藍圖圖”的要求，在從供體細胞中提取出的目的基的要求，在從供體細胞中提取出的目的基因中加入專一性很強的限制性核酸內切酶進行因中加入專一性很強的限制性核酸內切酶進行處理，從而獲得帶有特定基因并暴露出粘性末處理，從而獲得帶有特定基因并暴露出粘性末端的端的DNADNA單

31、鏈部分。必要時這種粘性末端也可單鏈部分。必要時這種粘性末端也可用人工方法合成。用人工方法合成。 對作為載體的細菌質?；蚴删w對作為載體的細菌質?；蚴删wDNADNA可采用與可采用與處理目的基因同一種類的限制性核酸內切酶進處理目的基因同一種類的限制性核酸內切酶進行處理，使其形成并暴露出與目的基因相應的行處理，使其形成并暴露出與目的基因相應的粘性末端。粘性末端。 3 3體外重組體外重組 將上述分別處理過的目的基因將上述分別處理過的目的基因和細菌質粒和細菌質粒DNADNA片段（或噬菌體核酸）放在試片段（或噬菌體核酸）放在試管中，在較低溫度（管中，在較低溫度（5 566）下混合）下混合“退火退火”。由

32、于這兩種由于這兩種DNADNA是用同一種限制性核酸內切酶是用同一種限制性核酸內切酶進行處理，具有相同的粘性末端，因此相互之進行處理，具有相同的粘性末端，因此相互之間能夠形成氫鍵，這就是所謂間能夠形成氫鍵，這就是所謂“退火退火”。而相。而相鄰的核苷酸，在鄰的核苷酸，在DNADNA連接酶的作用下也能形成連接酶的作用下也能形成磷酸二酯鍵，這樣就完成了目的基因與質粒磷酸二酯鍵，這樣就完成了目的基因與質粒DNADNA（或噬菌體或噬菌體DNADNA）的重組，得到的是一個完的重組，得到的是一個完整的具有復制能力的環(huán)狀整的具有復制能力的環(huán)狀DNADNA重組體，即重組體，即“雜雜種質粒種質?！保ɑ螂s種噬菌體）。

33、（或雜種噬菌體）。 4載體傳遞 即通過載體將供體生物中的遺傳基因導入到受體細胞內。載體必須具有自我復制的能力，一般可利用質粒的轉化作用或噬菌體的轉導作用，將供體基因帶入受體細胞內。對原核受體細胞來說，載體主要有兩種：細菌質粒和噬菌體對真核細胞來說載體主要有SV40病毒對植物來說載體主要是Ti質粒 5復制、表達 在理想情況下，進入受體細胞內的雜種質粒（或雜種噬菌體），可通過自我復制到擴增，并使受體細胞表達出作為供體細胞所固有的部分遺傳性狀，成為“工程菌”。 廣泛應用的受體細胞：E.Coli 枯草芽孢桿菌和釀酒酵母 6篩選、繁殖 當前，由于分離純凈的基因功能單位還很困難，所以通過重組后的“雜種質粒

34、”的性狀是否都符合原定的“設計藍圖”，以及它能否在受體細胞內正常增殖和表達等，都還需要經過仔細檢查，以便能在大量個體中設法篩選出所需要性狀的個體，然后才可加以繁殖和利用。2、平末端的連接：可先生成粘性末端，在帶平頭末端的DNA片段的3-末端加上多聚核苷酸的尾巴，在載體上加上互補的尾巴，然后用DNA連接酶連接。 生產多肽類藥物、疫苗中的應用生產多肽類藥物、疫苗中的應用改造傳統(tǒng)工業(yè)發(fā)酵菌種改造傳統(tǒng)工業(yè)發(fā)酵菌種動、植物特性的基因工程改良動、植物特性的基因工程改良基因工程在環(huán)境保護中的應用基因工程在環(huán)境保護中的應用(1)質粒育種多功能超級菌的構建多功能超級菌的構建 日本京都大學農學研究科應用微生物學教

35、授村田幸作領導的研究小組成功利用轉基因技術培養(yǎng)出一種超級細菌：將鞘氨醇單胞菌屬的一種細菌的5個遺傳基因提取后，植入另外一種分解二惡英細菌的基因內制造了這種超級細菌，其對高濃度二惡英具有耐藥性，在被污染的現(xiàn)場生存能力強，可持續(xù)分解。多功能超級菌的構建多功能超級菌的構建 目前研究小組正在研究利用轉基因技術改造其它種類的細菌，用以凈化重金屬等有害物質或高效率制造有用物質。 這一研究成果已刊載于2006年出版的自然生物技術上 19721972年美國的查可巴瑞開創(chuàng)了一項研究：直接年美國的查可巴瑞開創(chuàng)了一項研究：直接將不同來源的降解性質粒組建到一個受體菌細將不同來源的降解性質粒組建到一個受體菌細胞內，能獲得胞內，能獲得降解多種污染物的超級菌降解多種污染物的超級菌。 19751975年他成功地在培養(yǎng)基上將年他成功地在培養(yǎng)基上將4 4種降解性質粒種降解性質粒轉到轉到1 1株細菌的細胞內，構建成舉世矚目的第株細菌的細胞內，構建成舉世矚目的第一個一個“超級菌超級菌”。該種超級菌能同時。該種超級菌能同時降解降解7 7種種以上的石油烴類化合物以上的石油烴類化合物，幾小時內的效果相當，幾小時內的效果相當于自然菌株一年以上