應(yīng)用cDNA-AFLP研究甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育差異表達(dá)基

1、應(yīng)用cDNA-AFLP研究甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育 差異表達(dá)基因吳建勇，沈俊儒，劉平武，楊光圣（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）摘要：【目的】顯性細(xì)胞核雄性不育（DGMS）是油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。為了更好地理解該不育系統(tǒng)的分子機(jī)理，對(duì)甘藍(lán)型油菜顯性核不育的育性相關(guān)基因進(jìn)行初步的研究?！痉椒ā坷胏DNA-AFLP對(duì)顯性核不育材料兩用系Rs1046AB的不育株和可育株進(jìn)行了對(duì)比分析?！窘Y(jié)果】共得到32個(gè)差異片段，分別屬于27個(gè)uniGene，其中在可育株中增強(qiáng)或特異表達(dá)的有26個(gè)，不育株中只有1個(gè)。17個(gè)可以在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到同源序列（包括EST），10

2、個(gè)沒有找到同源序列。對(duì)17個(gè)已知序列的分析表明，這些片段參與了代謝、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)修飾、細(xì)胞間運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和花發(fā)育等相關(guān)過程。此外，Northern印跡分析結(jié)果表明檢測片段的表達(dá)模式與PAGE膠結(jié)果一致。【結(jié)論】本研究為更深入的研究甘藍(lán)型油菜顯性核不育的育性相關(guān)基因提供了基礎(chǔ)，并對(duì)雄配子的發(fā)育研究也具有一定參考價(jià)值。關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜；顯性細(xì)胞核雄性不育；cDNA-AFLP；雄配子發(fā)育Differentially Distinguished Expressed Genes in Dominant Genic Male Sterility (DGMS) Brassica napus U

3、sing cDNA-AFLP WU Jian-yong, SHEN Jun-ru, LIU Ping-wu, YANG Guang-sheng(National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)Abstract: 【Objective】 Dominant genic male sterility (DGMS) is an important way to utilize the heterosis of Brassica napus. So, p

4、ilot studies were conducted for better understanding the mechanism of the DGMS. 【Method】 By using cDNA-AFLP, the fertile plants and sterile plants between the homozygous DGMS two-type line Rs1046AB were studied. 【Result】There were 32 differentially expressed bands between them which belonged to 27 u

5、niGene. Among them, 26 bands were only expressed or expressed in a higher level in fertile plants, and only 1 band in sterile plants. 17 bands could find homologous sequence, but the other 10 bands were maybe some novel genes. The 17 homologous sequences participated in the following biological proc

6、ess: metabolism, transcription, cell cycle, protein fate, signal transduction mechanism, cellular transport and flower development etc. Furthermore Northern blot demonstrates that it was consistent with the result of PAGE. 【Conclusion】This research could give basic information about the dominant gen

7、ic male sterility in Brassica napus and male gametogenesis.Key words: Brassica napus; Dominant genic male sterility; cDNA-AFLP; Male gametogenesis0 引言【本研究的重要意義】顯性細(xì)胞核雄性不育（DGMS）是油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑，其突出優(yōu)點(diǎn)是敗育徹底，并能實(shí)現(xiàn)三系配套，可以產(chǎn)生100%的不育系群體，種子生產(chǎn)時(shí)不必拔掉50%的可育株。而如果能對(duì)該不育系統(tǒng)的分子機(jī)理進(jìn)行研究，將為更好的利用這一材料打下基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】李樹 林13、董振生4等通過

8、多年研究揭示了顯性核不育的遺傳規(guī)律，并在此基礎(chǔ)上建立了以純合兩型系、臨保系和恢復(fù)系三系配套的制種模式5。周熙榮等6利用該模式選育了顯性核不育雙低油菜雜交新品種核雜3號(hào)。陸光遠(yuǎn)等7找到了與不育基因緊密連鎖的標(biāo)記。從研究技術(shù)上來看，cDNA-AFLP是Bachem等8以AFLP為基礎(chǔ)發(fā)明的RNA指紋分析技術(shù)。其特點(diǎn)是重復(fù)性好，假陽性率低；而且該技術(shù)不需要預(yù)先了解研究材料的序列信息，有利于發(fā)現(xiàn)新基因；此外該方法只需較少的起始材料（100200 mg左右）。因此該技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域：（1）構(gòu)建轉(zhuǎn)錄連鎖圖，如Brugmans等9構(gòu)建了擬南芥和馬鈴薯表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄連鎖圖；（2）基因表達(dá)

9、特征的研究，如Dit等10研究了植物對(duì)根瘤土壤桿菌感染的反應(yīng)；（3）分離特異表達(dá)基因，如吳才君等11分析了雜種與親本蓮座期葉片的基因差異表達(dá)類型與構(gòu)成主要生物學(xué)產(chǎn)量性狀的雜種優(yōu)勢關(guān)系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然該不育系統(tǒng)已經(jīng)得到一定的應(yīng)用，但是，在實(shí)際應(yīng)用中，尋找同源兩型系和恢復(fù)系仍然是比較困難的工作。而且，到目前為止，對(duì)于顯性核不育的分子機(jī)理目前了解的仍然很少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)利用cDNA-AFLP研究甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育敗育關(guān)鍵時(shí)期的花藥，以期得到與育性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄片段（TDF），從而了解近等基因系Rs1046AB之間的基因表達(dá)差異，對(duì)育性控制的分子機(jī)制進(jìn)行初步探討，為更好的利用

10、這一材料奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料與取材甘藍(lán)型油菜顯性核不育系Rs1046A（MsMsrfrf）及其表型正常的姊妹系Rs1046B（MsMsRfrf）由國家油菜改良武漢分中心（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究室）提供，2003年10月2日種植在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜試驗(yàn)地。2004年34月確定其育性后收獲花粉母細(xì)胞時(shí)期花藥，放入液氮中速凍，保存于-80冰箱中備用。1.2 cDNA-AFLP總RNA提取采用Qiagen RNeasy plant Mini Kit，按其說明書操作。雙鏈cDNA合成采用LD-PCR的方法（Clontech SMARTTM cDNA Library Construction

11、Kit。AFLP參照Bachem等8,12方法，反應(yīng)產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上分離，顯影步驟參照陸光遠(yuǎn) 等13的方法。1.3 差異片段的回收、克隆、測序和分析將目的差異片段直接從聚丙烯酰胺凝膠上用滅菌的刀片切下，放入離心管，加入50 µl ddH2O，充分搗碎，煮沸10 min，稍微離心，上清液即可作為再擴(kuò)增反應(yīng)的模板。擴(kuò)增產(chǎn)物利用BBI EZ Spin Column PCR Product Purification Kit進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物用Promega pGEM-T Vector system 進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，單克隆經(jīng)驗(yàn)證后送上海生工測序。測序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫（htt

12、p://BLAST）進(jìn)行分析，分析結(jié)果根據(jù)MIPS A. thaliana Genome Database （http:/mips.gsf.de/proj/funcatDB/search_main_frame.html）進(jìn)行功能歸類。1.4 Northern雜交Northern雜交的轉(zhuǎn)膜和雜交過程參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版）中的Southern印跡程序。探針標(biāo)記采用TaKaRa Random Primer DNA Labeling Kit，65雜交1216 h，-80自顯影1周左右。2 結(jié)果與分析2.1 cDNA的合成LD-PCR梯度試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)循環(huán)

13、數(shù)為21時(shí)，點(diǎn)樣孔附近已經(jīng)有明顯的拖帶，說明反應(yīng)已經(jīng)過了平臺(tái)期，而循環(huán)數(shù)為18時(shí)，條帶較亮，而且沒有明顯拖帶，表明剛好到達(dá)平臺(tái)期，因此本試驗(yàn)采用17個(gè)循環(huán)進(jìn)行LD-PCR。2.2 AFLP分析本試驗(yàn)共用16對(duì)引物（256種引物組合）在可育材料和不育材料中進(jìn)行了擴(kuò)增，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)，每個(gè)泳道大約有20條帶左右。最后篩選到23對(duì)有多態(tài)性的引物對(duì)，圖1-A顯示的是經(jīng)過篩選后有多態(tài)性的引物對(duì)擴(kuò)增所得到的部分結(jié)果。圖1-B展示了試驗(yàn)中所獲得的2種差異帶型：有無差異和表達(dá)量差異。最終本實(shí)驗(yàn)得到32個(gè)能重復(fù)出現(xiàn)的差異片段，大約只占所有擴(kuò)增片段的0.31%，說明這個(gè)近等基因系可育材料和不育材料間遺傳背景很相似。2.

14、3 差異片段功能分析獲得的差異片段經(jīng)Blast分析表明它們屬于27個(gè)uniGene，結(jié)果見表1。然后根據(jù)生物過程（biological process）和MIPS A. thaliana Genome Database對(duì)這些差異片段進(jìn)行功能歸類，結(jié)果見表2。從表2可以看到，27個(gè)片段共參與了28個(gè)生物學(xué)過程，但只有10個(gè)片段所參與的過程是已知的，包括代謝、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)修飾、細(xì)胞間運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和花發(fā)育等，這些過程與雄配子的發(fā)育都有關(guān)系。其余17個(gè)（約60.7%）片段則是沒有同源性或功能未知的，表明可能得到了與雄配子發(fā)育相關(guān)的新基因。2.4 Northern雜交分析A. AFLP擴(kuò)增圖

15、 B. 差異片段A. Amplification of AFLP B. Differential bandsA是使用經(jīng)過篩選后的23對(duì)多態(tài)性引物擴(kuò)增所得到的部分結(jié)果。B中箭頭1標(biāo)示有無差異的差異帶，箭頭2則標(biāo)示表達(dá)量有差異的帶型A was the partial result of amplification using the screened 23 polymorphic primers. In figure B, arrow 1 represented the differentially band that only was observed in Rs1046B, arrow 2 r

16、epresented the differentially band that was expressed in different levels in two materials 圖1 AFLP擴(kuò)增和差異片段Fig.1 Amplification of AFLP and differentially bands為了保證實(shí)驗(yàn)的可信性，對(duì)部分差異片段進(jìn)行了Northern雜交分析，其中與花發(fā)育相關(guān)的片段以及不育株特異片段的Norhern印跡如圖2。結(jié)果表明，花發(fā)育相關(guān)片段的Northern雜交結(jié)果與PAGE膠的結(jié)果一致；而不育材料中的特異片段，Northern雜交的結(jié)果和PAGE膠有所不同，其可

17、能原因是：該片段在PAGE膠上信號(hào)較弱，而銀染法的檢測靈敏度有限，因此PAGE膠上可育材料不能檢測到該片段，但是Northern雜交的檢測靈敏度要高許多，所以能在兩材料中都檢測到較弱的信號(hào)，不過仍然可以看出在不育材料中是上調(diào)表達(dá)的，因此Northern雜交結(jié)果與PAGE膠結(jié)果也是吻合的。這些表明本研究所得結(jié)果是可靠的，而且，cDNA-AFLP應(yīng)用于油菜的基因差異表達(dá)分析是完全可行的。3 討論目前研究差異表達(dá)基因的方法很多，與其它方法相比cDNA-AFLP具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：（1）重復(fù)性好，本試驗(yàn)中的差異片段可以穩(wěn)定地重復(fù)出現(xiàn)，即使是不同年份取的材料也能擴(kuò)增得到相同的差異片段；（2）假陽性率低，本

18、試驗(yàn)選取部分片段的Northern雜交表表1 Blast分析結(jié)果Table 1 Result of Blast 編號(hào)IDNCBI登錄號(hào)Accession No.得分/E值Score/E序列信息Content10-11-1Z19120418/e-114A.thaliana mRNA for RNA polymerase II second largest subunit3-11-2AY376734113/2e-22Arabidopsis thaliana 4-coumarate CoA ligase isoform 10 mRNA,complete cds13-11NM_114696157/1e

19、-35Arabidopsis thaliana cysteine proteinase, putative (At3g48350) mRNA, complete cds5-16-1AL16150894/2e-16Arabidopsis thaliana DNA chromosome 4, contig fragment No. 204-3NM_12510296/3e-17Arabidopsis thaliana epsin N-terminal homology (ENTH) domain-containing protein3-3NM_100039161/1e-36Arabidopsis t

20、haliana fringe-related protein (At1g01570) mRNA, complete cds.6-9NP_18190196/2e-19lectin-related (Arabidopsis thaliana.)5-16-5NM_10552564/8e-08Arabidopsis thaliana oxidoreductase family protein (At1g68540) mRNA, complete cds.13-14-1NM_128304123/2e-25Arabidopsis thaliana rac GTPase activating protein

21、, putative (At2g27440) mRNA, complete cds12-4-2CD81300354/7e-05BN15.001D24F011204 BN15 Brassica napus cDNA clone BN15001D24, mRNA sequence13-14-2CD818704123/1e-25BN20.046G15F011220 BN20 Brassica napus cDNA clone BN20046G15, mRNA sequence14-7CD829365141/4e-31BN40.041O08F011207 BN40 Brassica napus cDN

22、A clone BN40041O08, mRNA sequence5-16-3AF458408222/2e-55Brassica oleracea glycine-rich protein (GRP1) mRNA, complete cds.5-16-4AY345237102/2e-21Brassica rapa MADS-box protein (AGL20) mRNA, complete cds.7-14-2CN54488064/9e-08EST0094 Apple developing fruit differentially expressed cDNA library Malus x

23、 domestica cDNA 5' similar to aspartate aminotransferase, mRNA sequence5-16-6S64617105/2e-20PCNA=proliferating cell nuclear antigen (Brassica napus=oilseed rape, cv. Westar, apical meristem, mRNA, 1004 nt).3-11-1CD84105290/4e-15RFO2.121K06F010608 RFO2 Brassica napus cDNA clone RFO2121K06, mRNA s

24、equence無同源性No homology10-1-2, 12-4-1, 13-14-5, 15-10, 2-6, 3-1-1, 4-11-1, 5-16-2, 7-14-1, 7-7表2 差異片段的生物過程歸類Table 2 Classify the differential bands by biological process生物學(xué)過程Biological process數(shù)量Amount比例(%)PercentMetabolism27Cell cycle and DNA processing14Transcription14Protein fate (folding, modifica

25、tion, destination)27Cellular transport, transport facilitation and transport routes27Cellular communication/signal transduction Mechanism14Flower development14Protein with binding function or cofactor requirement 14Function unknown27EST51No homology1031 2 3A是片段5-16-4 （AGL20） Northern雜交的結(jié)果。B是不育株中特異表達(dá)

26、的片段5-16-6的Northern雜交圖。圖中左邊的箭頭指向PAGE膠上的差異帶；右邊箭頭表示轉(zhuǎn)到膜上的RNA的兩條帶：28S和18S。A was the result of Northern blot of band 5-16-4(AGL20). B was the result of the special band expressed in sterile plants. The arrow on the left side indicated the differential band on the PAGE; and the right one indicated the two

27、bands (28S and 18S) of total RNA transfered to nylon membrance1PAGE膠；2Northern雜交；3Total RNA轉(zhuǎn)膜效果1. Figure of PAGE; 2. Result of Northern blot; 3. Total RNA transfered to nylon membrane圖2 Northern雜交Fig.2 Result of Northern blot明結(jié)果與PAGE膠一致，說明該技術(shù)所獲得的差異片段比較可靠，與DDRT-PCR近70%的假陽性率相比這是一個(gè)突出的優(yōu)勢；（3）cDNA-AFLP只需很

28、少的起始材料（只需200 mg左右），通過LD-PCR就可以得到足夠的雙鏈cDNA，這一點(diǎn)對(duì)于像本試驗(yàn)一樣難以取到大量材料的情況來說顯得尤為重要。但是在LD-PCR過程中，必須注意PCR反應(yīng)平臺(tái)期的因素，循環(huán)數(shù)過多會(huì)增加非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物。256種引物組合擴(kuò)增結(jié)果顯示，每個(gè)泳道大約有20條帶左右，這與以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增能得到平均34.5條帶14相比要少很多，李凌等15認(rèn)為這主要是因?yàn)榭侱NA中含有內(nèi)含子，而cDNA中沒有內(nèi)含子，只有表達(dá)基因。最終在2個(gè)材料間得到了32個(gè)重復(fù)性好的差異片段，其中31個(gè)在可育材料中增強(qiáng)或特異表達(dá)，只有1個(gè)在不育材料中增強(qiáng)表達(dá)?？赡艿脑蛴卸浩湟?，在敗育關(guān)鍵時(shí)

29、期，不育材料的雄配子發(fā)育過程就終止了，而可育材料雄配子繼續(xù)正常發(fā)育，因此可育材料中檢測到的大部分差異片段可能是下游表達(dá)的產(chǎn)物；其二，不育材料和可育材料前期的基因表達(dá)情況相似，不育材料中出現(xiàn)的差異帶應(yīng)該很少。油菜雄配子發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，目前所獲得的擬南芥雄性不育相關(guān)基因大部分是通過對(duì)突變體的研究和反向遺傳學(xué)的方法而發(fā)現(xiàn)的16。雄配子發(fā)育過程涉及上萬個(gè)基因，而且與這些基因嚴(yán)格的時(shí)空表達(dá)有關(guān)系，此外體內(nèi)外因子對(duì)這種表達(dá)調(diào)控的也有很大影響，任何一個(gè)基因或體內(nèi)外調(diào)控因子的變化或者異常都可能引起花藥發(fā)育的不正常，從而導(dǎo)致雄性不 育17, 18。本試驗(yàn)所用的顯性核不育材料Rs1046AB派生于宜3A，通

30、過楊光圣等19電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，其敗育關(guān)鍵時(shí)期為花粉母細(xì)胞時(shí)期，即這一時(shí)期后，不育材料的雄配子發(fā)育就不正常了，表現(xiàn)為雄配子發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制或者根本就不表達(dá)，這也就是cDNA-AFLP能夠檢測到2種差異帶型（有無的差異和表達(dá)量上的差異）的原因。這與王學(xué)德等20所研究的水稻雄性不育差異顯示情況相似。但是，由于對(duì)雄配子發(fā)育的分子機(jī)制了解的仍然很少，特別是關(guān)于發(fā)育前期即四分體以前的時(shí)期17，其中涉及的大量基因仍然有待研究。本試驗(yàn)所獲得的27個(gè)uniGene中有10個(gè)不能找到同源序列也說明了這個(gè)問題。對(duì)于17個(gè)能找到同源序列的差異片段，因?yàn)槊總€(gè)基因所涉及的功能較多，所以，本試驗(yàn)從其參與的biolo

31、gical process考慮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些片段涉及代謝、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)修飾、細(xì)胞間運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和花發(fā)育等相關(guān)過程。其中涉及花發(fā)育的相關(guān)基因?yàn)锳GL20，這一基因在可育材料中增強(qiáng)表達(dá)（圖2），而已有的報(bào)道表明，該基因參與了控制開花的redundant vernalization、autonomous和photoperiod 這3條主要的代謝途徑21,22，而且這一基因的過量表達(dá)表明該基因不僅可以抑制遲開花基因FRI 和 FLC，而且對(duì)于植物從營養(yǎng)組織向生殖組織的轉(zhuǎn)變同樣起著重要的調(diào)節(jié)作用21。通過田間觀察發(fā)現(xiàn)可育材料比不育材料開花確實(shí)有所提前，說明該基因?qū)τ诳刂崎_花時(shí)間所起的作用，但

32、是該基因是否對(duì)該材料育性產(chǎn)生影響還不好定論；有可能是營養(yǎng)組織向生殖組織轉(zhuǎn)變過程中的微小差異引起后期雄配子發(fā)育的不正常。此外找到的其他差異片段所涉及的過程，如代謝、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期等都是植物雄配子發(fā)育過程所必須的，因此本試驗(yàn)為雄配子發(fā)育的研究提供了基礎(chǔ)。雖然本試驗(yàn)可能不能得到直接與該材料育性相關(guān)的關(guān)鍵基因，但是所得到的片段可能是與雄配子發(fā)育相關(guān)的基因，而且所得到的差異片段是2種材料在花粉母細(xì)胞時(shí)期某一關(guān)鍵基因的表達(dá)不同而檢測到的下游表達(dá)產(chǎn)物，所以通過了解這些差異片段共同的調(diào)控機(jī)制，有可能找到花粉母細(xì)胞時(shí)期與育性相關(guān)的關(guān)鍵基因。4 結(jié)論 本研究利用cDNA-AFLP技術(shù)對(duì)甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育

33、的差異表達(dá)基因進(jìn)行了初步的研究。最終在可育材料和不育材料間得到了32個(gè)差異片段，通過Blast等分析，對(duì)這些片段所參與的生物學(xué)過程也進(jìn)行了初步的研究。此外，通過Northern雜交對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信性也進(jìn)行了驗(yàn)證。因此，本研究為更深入的研究甘藍(lán)型油菜顯性核不育的育性相關(guān)基因提供了基礎(chǔ)，而且對(duì)雄配子的發(fā)育研究也具有一定參考價(jià)值。References1 李樹林, 錢玉秀, 吳志華. 甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育的遺傳規(guī)律探討及其應(yīng)用. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1985, 1(2): 1-12.Li S L, Qian Y X, Wu Z H. Inherit genetic sterility in Brass

34、ica napus and its application to commercial production. Acta Agriculturae Shanghai, 1985, 1(2): 1-12. (in Chinese)2 李樹林, 錢玉秀, 吳志華. 甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育的遺傳驗(yàn)證. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1986, 2(2): 1-8.Li S L, Qian Y X, Wu Z H. Genetic confirmation on genic male sterility in rapeseed (Brassica napus). Acta Agriculturae Shangha

35、i, 1986, 2(2): 1-8. (in Chinese)3 Li S L, Qian Y X, Wu Z H. Genetic male sterility in rape (B. napus L.) conditioned by interaction of genes at two loci. Canadian Journal of Plant Science, 1988, 68: 1115-1118.4 董振生, 趙志海. 論油菜顯性核不育材料基因的互作兼與李樹林先生商榷. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2000, 9(1): 91-95.Dong, Z S, Zhao Z H. Discus

36、ses on dominant nuclear male sterile gene interaction in rape and Li's viewpoint. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica, 2000, 9(1): 91-95. (in Chinese)5 李樹林, 周志疆, 周熙榮. 油菜顯性核不育三系法制種. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1995, 11(1): 21-26.Li S L, Zhou Z J, Zhou X R. Three-line method of genetic male sterility for hy

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