人促甲狀腺素受體膜外區(qū)基因克隆及真核表達(dá)

1、人促甲狀腺素受體膜外區(qū)基因克隆及真核表達(dá)         11-01-06 09:09:00     編輯：studa20                    作者：李雪萍，施秉銀，武敏，伍麗萍，劉陜西【摘要】  目的 克隆人促甲狀腺激素受體胞外段基因，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒，獲

2、得具有免疫學(xué)活性的純化重組蛋白。方法 應(yīng)用RTPCR技術(shù)從人甲狀腺組織得到TSHR膜外區(qū)cDNA，插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+),轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,RTPCR鑒定基因轉(zhuǎn)錄，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法和Western Blot鑒定表達(dá)蛋白。結(jié)果 經(jīng)測(cè)序證實(shí)篩選得到的重組體中存在序列正確的TSHR膜外區(qū)基因，表達(dá)蛋白具有免疫活性。結(jié)論 成功克隆了人促甲狀腺素受體膜外區(qū)基因和構(gòu)建了真核表達(dá)載體,并將其在真核細(xì)胞中成功表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】  自身免疫性甲狀腺疾病;人促甲狀腺素受體;基因重組;真核表達(dá)ABSTRACT: Objective To clone and construct the p

3、lasmid containing human thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) gene ectodomain, and then identify the immunoreactivity of the purified recombinant protein. Methods TSHR total RNA was extracted from human thyroid, and cDNA was obtained with RTPCR technique. Human TSHR ectodomain gene (hETSHR) wa

4、s cloned into pcDNA3.1(+) vector. The recombined construct was transfected into CHO cells by Lipofectin 2000. The transcript mRNA was detected by RTPCR, and protein immunoreactivity was assayed by TSHR antibody with immunocytochemistry staining and Western blot. Results DNA sequencing results showed

5、 that the recombinant of human thyrotropin receptor ectodomain had confirmed sequence reported in GenBank. The fusion protein had the immunoreactivity. Conclusion Human thyroid stimulating hormone receptor was successfully cloned in eukaryotic expression vector and the constructor was expressed in e

6、ukaryotic cells very well.KEY WORDS: autoimmune thyroid disease; human thyroid stimulating hormone receptor; gene recombination; eukaryotic expression人促甲狀腺素受體(thyroid stimulating hormone receptor, TSHR)存在于甲狀腺細(xì)胞膜上，對(duì)甲狀腺正常生長(zhǎng)、發(fā)育及功能維持發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也是自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease, AITD)最重要的自身抗原1。機(jī)體產(chǎn)生針

7、對(duì)TSHR的自身抗體(thyroid receptor antibody, TRAb)是其主要的發(fā)病機(jī)制。由于存在于甲狀腺細(xì)胞膜上的TSHR數(shù)量少，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且難以純化，無(wú)法開(kāi)展TSHR的進(jìn)一步研究。本文從人甲狀腺中提取RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得TSHR膜外區(qū)cDNA，構(gòu)建真核表達(dá)載體，體外表達(dá)了TSHR蛋白，為進(jìn)一步建立新的AITD自身抗體檢測(cè)方法、建立AITD動(dòng)物模型等奠定了基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料 甲狀腺組織取自患者手術(shù)過(guò)程切除的甲狀腺組織。RTPCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠純化試劑盒購(gòu)于上海博亞生物技術(shù)公司。pMD18T載體、限

8、制性?xún)?nèi)切酶EcoR、BamH及DNA連接試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)、RNA提取Trizol試劑盒、陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectin Reagent 2000、細(xì)胞培養(yǎng)液、抗生素G418購(gòu)自Invitrogen公司。鼠抗人TSHR單克隆抗體、Actin抗體購(gòu)自ABCAM公司。免疫細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Vector公司。Western blot用BIORAD電轉(zhuǎn)膜儀。中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞(Chinese hamster oocyte, CHO)由第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心提供。RTPCR檢測(cè)hETSHR mRNA在CHO細(xì)胞表達(dá)所用的上游引物為：5CCATCAGGA

9、GGAGGACTTCAGAGTCACC3;下游引物5CAGTGGCTTGGGTAAGAAAGGTCAGCCC3。內(nèi)參照(actin)購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。上游引物為：5CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3;下游引物為：5ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3。1.2 pcDNA3.1(+)/hETSHR表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 人TSHR胞外段(human TSHR ectodomain gene, hETSHR)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的詳細(xì)步驟參閱文獻(xiàn)2，簡(jiǎn)述如下：取甲狀腺組織100mg，總RNA的提取采用Trizol試劑，按照試劑盒步驟操作。RTPCR擴(kuò)增獲得目的基因 PCR產(chǎn)物經(jīng)

10、純化后與pMD18T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5，利用氨芐青霉素抗性篩選出陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序后證明序列正確的陽(yáng)性克隆子大量擴(kuò)增后，以EcoR和BamH雙酶切質(zhì)粒pMD18ThETSHR，獲得含人促甲狀腺激素受體膜外區(qū)(hETSHR)cDNA，長(zhǎng)度約1254bp，并以低熔點(diǎn)瓊脂糖回收純化，同時(shí)pcDNA3.1(+)也經(jīng)上述兩種內(nèi)切酶酶切，回收5.4kb大片段，將兩者經(jīng)T4DNA連接酶于16連接過(guò)夜，以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5，氨芐青霉素篩選，提取質(zhì)粒并再次測(cè)序鑒定。1.3 陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞 復(fù)蘇CHO細(xì)胞，按常規(guī)方法用含10mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前24h，胰酶消化收

11、集細(xì)胞，以2.5×105/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合率達(dá)80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別提取pcDNA3.1(+)空載體質(zhì)粒和pcDNA3.1/hETSHR，經(jīng)分光光度計(jì)和電泳檢測(cè)，A260/A280>1.9，且無(wú)任何降解的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染。分別取上述制備好的質(zhì)粒1.5g，加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中，總體積為100L，混勻，于室溫靜置40min。6L脂質(zhì)體加入無(wú)血清、無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基至100L，兩者再混勻后，室溫靜置15min，不時(shí)輕輕搖勻。將細(xì)胞用無(wú)血清DMEM洗3次，每孔加入800L的DMEM，然后逐滴加入上述置備好的200L脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物，于37、50mL/L CO2

12、培養(yǎng)4h。同時(shí)留1孔細(xì)胞不加質(zhì)粒作為空白對(duì)照。棄去轉(zhuǎn)染液，換用含50mL/L血清，500g/L G418的DMEM培養(yǎng)液2mL繼續(xù)孵育72h，PBS洗滌收集細(xì)胞，完成表達(dá)產(chǎn)物的鑒定。1.4 RTPCR檢測(cè)hETSHR mRNA的表達(dá) 取轉(zhuǎn)染后收集的CHO細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA;核酸定量分析儀檢測(cè)A260/A280及RNA含量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)：反應(yīng)體系中加入提取的總RNA(1g)、Oligo(dT) 1L、dNTP 2L加DEPC水至12L，放置于70水浴中5min，然后置于冰上。將4L cDNA合成緩沖液、1L DTT、1L RNaseOUT(40u/mL)、1L DEPC水和1L AMV反轉(zhuǎn)錄酶混合(共8L)，再加入上述12L反應(yīng)體系中，并充分混合，42孵育60min;70孵育10min終止反應(yīng)即可得到