實(shí)驗(yàn)七SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的分ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)學(xué)習(xí)SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理掌握垂直板電泳的操作方法掌握垂直板電泳的操作方法 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)，簡(jiǎn)稱(chēng)Acr)和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙甲叉雙丙烯酰胺丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)Bis)在催化劑和加速劑的作用下聚合并聯(lián)成三維在催化劑和加速劑的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀構(gòu)造的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳網(wǎng)狀構(gòu)造的凝膠，以此凝膠為支持物

2、的電泳稱(chēng)為聚丙烯酰胺凝膠電泳稱(chēng)為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱(chēng)，簡(jiǎn)稱(chēng)PAGE)。 二、實(shí)驗(yàn)原理 SDS即十二烷基硫酸鈉是陰離子去污劑，與大多即十二烷基硫酸鈉是陰離子去污劑，與大多數(shù)蛋白質(zhì)平均結(jié)合比為數(shù)蛋白質(zhì)平均結(jié)合比為1.4g SDS/g蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)。由于SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷大大超越了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，帶的負(fù)電荷大大超越了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因此消除或掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有電荷的因此消除或掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有電荷的差別，使蛋白質(zhì)均帶有

3、一樣密度的負(fù)電荷，因此差別，使蛋白質(zhì)均帶有一樣密度的負(fù)電荷，因此可利用分子量差別將各種蛋白質(zhì)分開(kāi)?？衫梅肿恿坎顒e將各種蛋白質(zhì)分開(kāi)。 在蛋白質(zhì)溶解液中，參與在蛋白質(zhì)溶解液中，參與SDS和疏基乙醇，巰和疏基乙醇，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵復(fù)原，使多基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵復(fù)原，使多肽分成單個(gè)亞單位。肽分成單個(gè)亞單位。SDS可使蛋白質(zhì)的氫鍵、可使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵翻開(kāi)，還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改動(dòng)。疏水鍵翻開(kāi)，還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改動(dòng)。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在水溶液中的外形近似雪茄形的蛋白質(zhì)復(fù)合物在水溶液中的外形近似雪茄形的長(zhǎng)橢圓棒。不同蛋白質(zhì)長(zhǎng)橢圓棒。不同蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的短軸一樣復(fù)合物

4、的短軸一樣 ，約約1.8nm，而長(zhǎng)軸那么與蛋白質(zhì)的，而長(zhǎng)軸那么與蛋白質(zhì)的Mr成正比。成正比。 蛋白質(zhì)分子的遷移速度只取決于分子大小。分蛋白質(zhì)分子的遷移速度只取決于分子大小。分子量在子量在15KD到到200KD之間時(shí)，之間時(shí)，lgMr=K-b*mR濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) 1凝膠孔徑的不延續(xù)性：在上述凝膠中，濃縮膠為大孔膠；分別膠為小孔膠。在電場(chǎng)作用下，樣品顆粒在大孔膠中泳動(dòng)的阻力小，挪動(dòng)速度快；當(dāng)進(jìn)入小孔膠時(shí)，遭到的阻力大，挪動(dòng)速度減慢。因此在兩層凝膠交界處，樣品遷移受阻而緊縮成很窄的區(qū)帶。 2緩沖體系離子成分及pH值的不延續(xù)性： 濃縮膠pH6.8，Tris-Cl 0.5 mol/L；三羥甲基氨基甲烷

5、 分別膠pH8.8，Tris-Cl 1.5 mol/L 電極緩沖液pH=8.30，為T(mén)irs-Gly緩沖液 濃縮膠，pH6.8，蛋白質(zhì)分子的遷移率比Cl- 低，比Gly高。 3電位梯度不延續(xù)性：快離子電位梯度不延續(xù)性：快離子 Cl- 后面構(gòu)成高電位梯度區(qū)，慢離子后面構(gòu)成高電位梯度區(qū)，慢離子Gly前前面構(gòu)成低電位梯度區(qū)，高電位梯度和低電面構(gòu)成低電位梯度區(qū)，高電位梯度和低電位梯度之間的地方，構(gòu)成一個(gè)穩(wěn)定而不斷位梯度之間的地方，構(gòu)成一個(gè)穩(wěn)定而不斷向陽(yáng)極挪動(dòng)的界面，蛋白質(zhì)分子在界面處向陽(yáng)極挪動(dòng)的界面，蛋白質(zhì)分子在界面處濃縮成一個(gè)狹小的中間層。濃縮成一個(gè)狹小的中間層。 這種在電泳開(kāi)場(chǎng)后產(chǎn)生的高電位梯度作

6、用這種在電泳開(kāi)場(chǎng)后產(chǎn)生的高電位梯度作用于蛋白和甘氨酸慢離子加速前進(jìn)，追逐快于蛋白和甘氨酸慢離子加速前進(jìn)，追逐快離子。本來(lái)夾在快慢離子之間的蛋白區(qū)帶，離子。本來(lái)夾在快慢離子之間的蛋白區(qū)帶，在這個(gè)追逐中被逐漸地緊縮聚集成一條更在這個(gè)追逐中被逐漸地緊縮聚集成一條更為狹窄的區(qū)帶。為狹窄的區(qū)帶。 蛋白質(zhì)離子進(jìn)入分別膠后，條件有很大變化。由于蛋白質(zhì)離子進(jìn)入分別膠后，條件有很大變化。由于其其pH 升高升高(電泳進(jìn)展時(shí)常超越電泳進(jìn)展時(shí)常超越9.0)，使，使Gly 解離成負(fù)解離成負(fù)離子的效應(yīng)添加；同時(shí)因凝膠的濃度升高，蛋白質(zhì)的離子的效應(yīng)添加；同時(shí)因凝膠的濃度升高，蛋白質(zhì)的泳動(dòng)遭到影響，遷移率急劇下降。此兩項(xiàng)變化

7、，使泳動(dòng)遭到影響，遷移率急劇下降。此兩項(xiàng)變化，使Gly 的挪動(dòng)超越蛋白質(zhì)，上述的高電壓梯度不復(fù)存在，的挪動(dòng)超越蛋白質(zhì)，上述的高電壓梯度不復(fù)存在，蛋白質(zhì)便在一個(gè)較均一的蛋白質(zhì)便在一個(gè)較均一的pH 和電壓梯度環(huán)境中，按和電壓梯度環(huán)境中，按其分子的大小挪動(dòng)。其分子的大小挪動(dòng)。分別膠的孔徑有一定的大小，對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量分別膠的孔徑有一定的大小，對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)時(shí)遭到的阻滯程度不同，即使凈的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)時(shí)遭到的阻滯程度不同，即使凈電荷相等的顆粒，也會(huì)由于這種分子篩的效應(yīng)，把不電荷相等的顆粒，也會(huì)由于這種分子篩的效應(yīng)，把不同大小的蛋白質(zhì)相互分開(kāi)。同大小的蛋白質(zhì)相互分開(kāi)。 分子篩效

8、應(yīng)分子篩效應(yīng) 在在pH8.9的分別膠中，各種帶凈電荷不同的的分別膠中，各種帶凈電荷不同的蛋白質(zhì)有不同的遷移率。凈電荷多，那么蛋白質(zhì)有不同的遷移率。凈電荷多，那么遷移快；遷移快； 反之，那么慢。反之，那么慢。 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物電荷密度一樣，靜電荷蛋白質(zhì)復(fù)合物電荷密度一樣，靜電荷量與蛋白質(zhì)分子量成相關(guān)。量與蛋白質(zhì)分子量成相關(guān)。電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)三、實(shí)驗(yàn)試劑三、實(shí)驗(yàn)試劑 低分子量規(guī)范蛋白protein marker： 兔磷酸化酶B MW=94000 牛血潔白蛋白 MW=66200 兔肌動(dòng)蛋白 MW=45000 牛碳酸酐酶 MW=33000 蛋白A MW=26000 胰蛋白酶抑制劑 MW=20000

9、 雞蛋清溶菌酶 MW=14400 (1) 單體母液?jiǎn)误w母液 30%丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合溶液丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合溶液 210%SDS 31.0mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液緩沖液 41.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液緩沖液 510%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨(APS)現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用 作用：提供引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合的自在基作用：提供引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合的自在基 6TEMED四甲基乙二胺四甲基乙二胺 作用：加速過(guò)硫酸銨構(gòu)成自在基作用：加速過(guò)硫酸銨構(gòu)成自在基 (7) 2樣品緩沖液樣品緩沖液 SDS、 甘油、巰基乙醇、溴酚蘭甘油、巰基乙醇、溴酚蘭 (

10、8) 2電極緩沖液母液電極緩沖液母液pH8.3 Tris，Gly，SDS (9) 染色液考馬斯亮藍(lán)染料染色液考馬斯亮藍(lán)染料 (10) 脫色液脫色液 甲醇、冰醋酸甲醇、冰醋酸 水溶液水溶液 四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 1.將玻璃板洗凈晾干將玻璃板洗凈晾干, 預(yù)備預(yù)備2個(gè)干凈的燒杯個(gè)干凈的燒杯 2.把玻璃板在灌膠支架上固定好把玻璃板在灌膠支架上固定好3.配好分別膠配好分別膠12ml,用小燒杯延續(xù)平穩(wěn)參與，用小燒杯延續(xù)平穩(wěn)參與，至凹槽高度的大約至凹槽高度的大約7/10處，之后加處，之后加0.5cm高正丁高正丁醇或蒸餾水，靜置醇或蒸餾水，靜置50分鐘分鐘凝膠配制過(guò)程中，凝膠配制過(guò)程中，TEMED要在注膠

11、前再參要在注膠前再參與，否那么凝結(jié)后無(wú)法注膠與，否那么凝結(jié)后無(wú)法注膠 12%的分別膠的分別膠12ml 膠濃度膠濃度1212單體母液?jiǎn)误w母液mlml4.804.80去離子水去離子水mlml4.204.20分別膠緩分別膠緩沖液沖液mlml3.003.001010APSAPSll5050TEMED(TEMED(l)l)1818 醇封的目的是為了使分別膠上沿平直，并排醇封的目的是為了使分別膠上沿平直，并排除氣泡。除氣泡。 凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與醇層之間構(gòu)成明晰凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與醇層之間構(gòu)成明晰的界面。的界面。4.倒出正丁醇倒出正丁醇,用去離子水清洗用去離子水清洗,并用濾紙吸干，并用濾紙吸干，配好濃

12、縮膠配好濃縮膠5ml，參與濃縮膠，迅速插入，參與濃縮膠，迅速插入樣梳，靜置約樣梳，靜置約50分鐘。分鐘。 樣梳需一次平穩(wěn)插入。梳口處不得有氣泡，樣梳需一次平穩(wěn)插入。梳口處不得有氣泡，梳底需程度。梳底需程度。 5.0%的濃縮膠的濃縮膠5ml膠濃度膠濃度5單體母液?jiǎn)误w母液ml0.75去離子水去離子水ml3.00濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液ml1.2510APSl40TEMED(l)125.拔出樣梳后，將玻板固定在電泳槽上，參與拔出樣梳后，將玻板固定在電泳槽上，參與電極緩沖液，上槽緩沖液液面要高過(guò)點(diǎn)樣孔，電極緩沖液，上槽緩沖液液面要高過(guò)點(diǎn)樣孔，下槽要沒(méi)過(guò)電極。下槽要沒(méi)過(guò)電極。6.點(diǎn)樣點(diǎn)樣Marker和待

13、測(cè)蛋白樣，參與等體積的和待測(cè)蛋白樣，參與等體積的2樣品緩沖液樣品緩沖液 加樣前，樣品在沸水中加熱加樣前，樣品在沸水中加熱3分鐘，以除掉分鐘，以除掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。亞穩(wěn)態(tài)聚合。 7.開(kāi)場(chǎng)電泳，電壓開(kāi)場(chǎng)電泳，電壓100V，溴酚藍(lán)進(jìn)入分別膠后改，溴酚藍(lán)進(jìn)入分別膠后改為為150V，距凝膠底邊約，距凝膠底邊約0.5cm時(shí)，停頓電泳。時(shí)，停頓電泳。8.凝膠板剝離與染色凝膠板剝離與染色 電泳終了后撬開(kāi)玻板，將電泳終了后撬開(kāi)玻板，將凝膠放在大平皿內(nèi)，參與染色液，染色凝膠放在大平皿內(nèi)，參與染色液，染色12-15min。剝膠時(shí)要小心剝膠時(shí)要小心,堅(jiān)持膠完好無(wú)損。堅(jiān)持膠完好無(wú)損。9.脫色：染色后的凝膠用蒸餾水漂洗，再用脫色脫色：染色后的凝膠用蒸餾水漂洗，再用脫色液脫色液脫色,每脫色每脫色15min后換一次脫色液，脫色后換一次脫色液，脫色3次。次。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析繪制規(guī)范曲線：繪制規(guī)范曲線：log Mr = K - bmRlog Mr = K - bmR 蛋白質(zhì)區(qū)帶中心至分別膠上沿間隔蛋白質(zhì)區(qū)帶中心至分別膠上沿間隔 相對(duì)遷移率相對(duì)遷移率= = 溴酚藍(lán)至分別膠上沿間隔溴酚藍(lán)至分別膠上沿間隔 以每個(gè)蛋白規(guī)范的分