分子生物學研究法

1、分子生物學基本研究法（上）分子生物學基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)及蛋白質(zhì)操作技術(shù)第五章 扉頁：扉頁： 當你進入實驗室時，要像脫去外衣那樣放下你當你進入實驗室時，要像脫去外衣那樣放下你的想象力，因為實驗操作中不能有一丁點兒的想象，的想象力，因為實驗操作中不能有一丁點兒的想象，否則，你對事物的觀察就會受影響；當你翻開書本否則，你對事物的觀察就會受影響；當你翻開書本的時候，你又必須盡可能展開想象的的時候，你又必須盡可能展開想象的“翅膀翅膀”，否，否則，你就不可能走在別人的前面。則，你就不可能走在別人的前面。RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)真核生物基因組真核生物基因組DNA龐大，有大量

2、重復序列，很難直龐大，有大量重復序列，很難直接分離得到靶基因片段。而接分離得到靶基因片段。而cDNA來自反轉(zhuǎn)錄的來自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，無冗余序列，通過篩選無冗余序列，通過篩選cDNA文庫，可較快文庫，可較快地分離到相關(guān)基因。地分離到相關(guān)基因。Trizol總總RNA提取試劑提取試劑 TIANGEN rRNA電泳后的三條特征性條帶電泳后的三條特征性條帶28S、18S、5S (特別是特別是28S和和18S特征性條帶特征性條帶) 是鑒定總是鑒定總RNA純度純度和完整性的重要參數(shù)。和完整性的重要參數(shù)。RNA的抽提方法RNA Extraction by TRIzol使用BioSpcetrometer分光光

3、度計進行快速檢測核酸mRNA Extraction from Cell CulturemRNA Extraction from Tissue5.32. mRNA的純化 寡聚（寡聚（dT）纖維素柱色譜法：）纖維素柱色譜法： 利用利用mRNA3端含有端含有PolyA+的特點，當?shù)奶攸c，當RNA流經(jīng)寡聚流經(jīng)寡聚dT纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，用下，mRNA被特異性地結(jié)合在柱上，再用被特異性地結(jié)合在柱上，再用低鹽溶液或蒸餾水洗脫低鹽溶液或蒸餾水洗脫mRNA。經(jīng)過兩次此。經(jīng)過兩次此柱可得到較高純度的柱可得到較高純度的mRNA.圖圖5-14PolyATtractmRNA的

4、分離的分離純化過程簡圖。純化過程簡圖。每個Oligotex Kit 包括用于結(jié)合poly A+ mRNA的Oligotex 樹脂，和用于洗滌、洗脫結(jié)合的mRNA的離心柱。Oligotex mRNA Kits可從總RNA中純化mRNA，回收poly A+體外轉(zhuǎn)錄子。Oligotex Direct mRNA Kits 可從細胞和組織中純化mRNA。mRNA Extraction from Total RNA5.3.3 cDNA的合成 cDNA（complementary DNA）：在體外以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶合成的一段雙鏈DNA。cDNA 的合成5.3.4 cDNA文庫的構(gòu)建

5、 cDNA文庫：文庫：是指將某種生物體基因組轉(zhuǎn)是指將某種生物體基因組轉(zhuǎn)錄的全部錄的全部mRNAmRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNAcDNA片段片段分別與克隆載體重組，儲存于某種受體分別與克隆載體重組，儲存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNAcDNA文庫。文庫。基因文庫的建立基因組基因組DNADNA文庫文庫cDNAcDNA文庫文庫基因組基因組DNADNA文庫與文庫與cDNAcDNA文庫的比較文庫的比較基因組文庫與基因組文庫與cDNA文庫的差別文庫的差別 基因組文庫中包含了所有基因，而基因組文庫中包含了所有基因，而cDNA文庫只包含表達的文庫只包含

6、表達的基因，缺乏內(nèi)含子和調(diào)控序列，在研究基因結(jié)構(gòu)時用處不大基因，缺乏內(nèi)含子和調(diào)控序列，在研究基因結(jié)構(gòu)時用處不大 cDNA文庫代表了文庫代表了mRNA的來源，轉(zhuǎn)錄本在豐度上有差別，的來源，轉(zhuǎn)錄本在豐度上有差別，而基因組文庫在理論上均等地代表了所有基因序列而基因組文庫在理論上均等地代表了所有基因序列 不同細胞類型制備的不同細胞類型制備的cDNA文庫包含一些共同序列和獨特序文庫包含一些共同序列和獨特序列，可用于分離差別表達的基因，基因組文庫中不能列，可用于分離差別表達的基因，基因組文庫中不能 基因組文庫由于含有不表達序列，比基因組文庫由于含有不表達序列，比cDNA文庫大文庫大 mRNA在不同組織之間存在豐度差異，因此在不同組織之間存在豐度差異，因此cDNA文庫在構(gòu)文庫在構(gòu)建時對于建時對于mRNA