長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素對大鼠股骨頭骨組織OPGRANKLmRNA表達(dá)的影響

1、長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素對大鼠股骨頭骨組織OPG/RANKL mRNA表達(dá)的影響         11-01-09 14:07:00     編輯：studa20              作者：王建忠，王坤正，時志斌，張明宇【摘要】  目的 觀察長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素對大鼠股骨頭骨組織中骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)/核因子

2、kappa B受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, RANKL)mRNA表達(dá)的影響，探討長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致股骨頭壞死的另一作用機(jī)制。方法 健康SD大鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為低、中、高劑量激素組和對照組，每組10只。低、中、高劑量激素組動物分別給予肌肉注射醋酸潑尼松龍7、12.5、25mg/kg體重，每周2次；對照組給予相同體積生理鹽水肌注。4周后取左側(cè)股骨頭骨組織石蠟包埋，HE染色，鑒定股骨頭壞死情況；取右側(cè)股骨頭骨組織提取總RNA，采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)技術(shù)檢測OPG和RANKL m

3、RNA的表達(dá)水平并計算OPG/RANKL比值。結(jié)果 低、中、高劑量激素組和對照組動物初期股骨頭壞死發(fā)生率分別為30%(3/10)、66.67%(6/9)、83.33%(5/6)、0(0/10)；低、中、高劑量激素組和對照組動物股骨頭骨組織OPG mRNA表達(dá)的相對量分別為1.12±0.17、0.96±0.16、0.83±0.18和1.60±0.49；RANKL mRNA表達(dá)的相對量分別為2.48±0.81、3.33±1.04、4.51±1.33和1.58±0.42。與對照組比較，3個激素組OPG mRNA表達(dá)降低，

4、且與激素用量呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；RANKL mRNA表達(dá)增高，與激素用量呈正相關(guān)，其中中、高劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素致股骨頭壞死的效應(yīng)可能與其調(diào)控OPG和RANKL mRNA表達(dá)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  糖皮質(zhì)激素；股骨頭；骨壞死；細(xì)胞因子ABSTRACT: Objective  To investigate the effect of longterm administration of glucocorticoid on expression level of osteoprotege

5、rin (OPG) and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL) mRNAs in bone tissues of femoral head of rats, and discuss its mechanism of action on glucocorticoidinduced necrosis of femoral head. Methods  Forty adult SD rats were randomly divided into 4 groups: lowdose glucocorticoi

6、d group (LD), mediumdose glucocorticoid group (MD), highdose glucocorticoid group (HD) and control group. The LD, MD and HD groups were treated by intramuscular injection of prednisolone 7, 12.5 and 25mg/kg body weight, respectively, and the control group was only treated by the same volume of sodiu

7、m chloride. After 4 weeks intervention, osteonecrosis of left femoral heads was detected by HE staining, the right femoral head bone tissue total RNA was extracted and the expression level of OPG and RANKL mRNAs was examined by realtime quantitative polymerase chain reaction. Results  The necro

8、sis rate of femoral head was 30%(3/10), 66.67%(6/9), 83.33%(5/6), and 0(0/10) in LD, MD, HD and control groups. The level of OPG mRNA was 1.12±0.17, 0.96±0.16, 0.83±0.18 and 1.60±0.49 in LD, MD, HD and control groups. The level of RANKL mRNA was 2.48±0.81, 3.33±1.04, 4.

9、51±1.33 and 1.58±0.42 in LD, MD, HD and control groups. Conclusion  The glucocorticoidinduced necrosis of femoral head may be related to the expression level of OPG/RANKL mRNAs regulated by glucocorticoid.KEY WORDS: glucocorticoid; femoral head; osteonecrosis; cytokine骨保護(hù)素(osteoproteg

10、erin, OPG)和核因子kappa B受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, RANKL)，直接影響著破骨細(xì)胞的分化及其功能，共同構(gòu)成調(diào)節(jié)骨重建的橫軸旁分泌系統(tǒng)，是大多數(shù)生物活性物質(zhì)介導(dǎo)骨吸收的最終和共有通路。作為破骨細(xì)胞形成、分化和骨吸收的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，OPG/RANKL系統(tǒng)在骨質(zhì)疏松、骨硬化病、骨關(guān)節(jié)炎、骨腫瘤、Pagets病及牙周疾病等的發(fā)病機(jī)制及治療方面的研究均取得了較大進(jìn)展18。但關(guān)于OPG/RANKL系統(tǒng)在激素性股骨頭壞死中的研究較少?；诖?，本研究采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(realtime q

11、uantitative polymerase chain reaction, RTPCR)技術(shù)，觀察糖皮質(zhì)激素對大鼠股骨頭骨組織中OPG/RANKL mRNA的表達(dá)水平的影響，探討激素性股骨頭壞死中的另一種可能途徑。1  材料與方法1.1  實驗動物 3月齡健康SD大鼠40只，雌雄各半，體重250-300g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。1.2  主要儀器與試劑ABI 7000型Real timePCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品；醋酸潑尼松龍由湖北制藥有限公司提供；骨組織RNA提取試劑Trizol為美國Invitrogen 公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反

12、應(yīng)試劑盒為立陶宛Fermentas公司產(chǎn)品；引物由大連寶生物工程有限公司合成。1.3  動物造模、分組及藥物處理 40只大鼠隨機(jī)分為低、中、高劑量激素組和對照組，每組10只。低、中、高劑量激素組分別給予醋酸潑尼松龍7、12.5、25mg/kg體重肌注，2次/周；對照組按同樣的方法給予相同容積的生理鹽水。1.4  組織學(xué)檢查 用藥4周后處死動物，取左側(cè)股骨頭，10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液固定，乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切成5m厚切片，HE染色后，顯微鏡下觀察，鑒定股骨頭壞死情況。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2006年我國制定的股骨頭壞死診斷和治療

13、的專家建議：骨活檢顯示骨小梁的骨細(xì)胞空陷窩多于50%，且累及鄰近多根骨小梁，有骨髓壞死。1.5  OPG/RANKL mRNA表達(dá)水平檢測 采用Real timePCR儀檢測大鼠骨組織中OPG和RANKL mRNA的表達(dá)水平。1.5.1  骨標(biāo)本總RNA的提取 處死大鼠，快速取出右側(cè)股骨頭，剔除軟骨，置于盛有1mL Trizol的研磨器中仔細(xì)研碎并孵育5min，加氯仿沉淀，離心取上清。用等體積異丙醇沉淀RNA，離心去上清，75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌，風(fēng)干后用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解。電泳證實提取總RNA完整。1.5.2  cDNA第1

14、鏈的合成 取總RNA 500ng，隨機(jī)引物1L，加DEPC處理水補(bǔ)至12L，70水浴5min，冰上冷卻；加入反應(yīng)緩沖液4L，dNTP 2L，RNA酶抑制劑1L，混勻后25水浴5min；加反轉(zhuǎn)錄酶MMLV RNase 1L，配制成20L反應(yīng)液。恒溫水浴25 10min，42 60min，70 10min，cDNA第1鏈合成，-70保存。1.5.3  定量RTPCR檢測 根據(jù)目的基因在GenBank中的己知序列，采用primer premier 5.0設(shè)計引物，引物序列見表1。選25L反應(yīng)體系，取SYBR Primix 12.5L，ROX Reference Dye 0.5L，上下游引物各0.5L，模板cDNA 50ng，采用Real timePCR儀，用三步法進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件均為預(yù)變性95 35s，1個循環(huán)；變性95 5s，退火58