丙型肝炎病毒實驗室檢測技術(shù)

1、目錄第一章 丙型肝炎. 11. 形態(tài)和基因組結(jié)構(gòu)12. 基因型23. 和細胞嗜性24. 致病性和免疫性3第二章 丙型肝炎抗體檢測51. 概述52. 抗-HCV 檢測的目的意義53. 抗-HCV 檢測的. 54. 抗-HCV 檢測策略及結(jié)果報告75. 檢測結(jié)果的解釋10第三章 丙型肝炎抗原檢測111. 概述112. HCV 抗原檢測的目的意義113. HCV 抗原檢測的. 114. 檢測策略及結(jié)果報告125. 檢測結(jié)果的解釋12第四章 丙型肝炎核酸檢測131. 概述132. HCV 核酸檢測的目的意義133. HCV 核酸檢測的. 134. 檢測策略及結(jié)果報告155. 檢測結(jié)果的解釋17第五章

2、丙型肝炎基因型檢測181. HCV 基因型182. HCV 基因型檢測與試劑183. 直接測序法HCV 分型操作程序194. HCV 基因分型的臨床意義20第六章 丙型肝炎細胞培養(yǎng)211. 丙型肝炎 的細胞培養(yǎng)模型212. 體外細胞培養(yǎng)技術(shù)在丙型肝炎 檢測中應(yīng)用的展望22第七章 實驗樣品的、保存、 . 241. 樣品 . 242. 樣品保存與. 24第八章 丙型肝炎檢測 的室內(nèi)質(zhì)量 及能力驗證261. 室內(nèi)質(zhì)量 . 26IV2. 檢測能力驗證30第九章 生物安全351. 丙型肝炎 相關(guān)檢測的生物安全級別352. 生物安全保障措施363. 安全操作374. 職業(yè)及其處理39參考文獻41前言丙型肝

3、炎是一種主要 液傳播的疾病，丙型肝炎 慢 染可導致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌，對患者的健康和生命產(chǎn)生危害。丙型肝炎（HCV）已呈全球性流行。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球 HCV 率約為 3%，估計約 1.7 億人 HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約 3.5 萬例。我國性肝炎的發(fā) 數(shù)一直位于傳染病的前列，丙型肝炎報告數(shù)在 性肝炎中也呈現(xiàn)上升趨勢。檢測在丙型肝炎發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮著不可替代的作用，是 丙型肝炎的重要依據(jù)。目前在我國疾病預(yù)防 機構(gòu)、醫(yī)療機構(gòu)、采供血機構(gòu)、出入境檢驗檢疫機構(gòu)等已經(jīng)廣泛開展丙型肝炎 檢測。但 檢測 諸多 ， 檢測策略不明確、檢測結(jié)果解釋不規(guī)范等問題。鑒于

4、此，為規(guī)范我國丙型肝炎 檢測，提高 檢測質(zhì)量，迫切需要制訂相應(yīng)的技術(shù)規(guī)范。受 委托， 疾病預(yù)防 中心 預(yù)防 中心于 2008 年 10 月 25 日在北京召開了首次丙型肝炎 檢測技術(shù)規(guī)范（以下 規(guī)范）編寫組工作會議。衛(wèi)生部及 疾病預(yù)防 中心從全國丙型肝炎防控的戰(zhàn)略層面，為規(guī)范編寫提出了幾點要求：要考慮為公共衛(wèi)生服務(wù)，考慮基層的具體情況，具有實用性及可操作性；要有發(fā)展的眼光， 考慮 發(fā)展和技術(shù)進步，具有一定的前瞻性；要有大局觀念，考慮各系統(tǒng)的發(fā)展。此后，中國疾病預(yù)防 中心 預(yù)防 中心組織國內(nèi)有關(guān) ，歷時兩年反復(fù)多次修改，并以多種方式征求各有關(guān)部門和領(lǐng)域的 、以及全國 網(wǎng)絡(luò)有關(guān)技術(shù) 意見和建議后，

5、制訂完成了 。規(guī)范共分九章， ：丙型肝炎 ，丙型肝炎 抗體檢測，丙型肝炎 抗原檢測，丙型肝炎 核酸檢測，丙型肝炎 基因型檢測，丙型肝炎細胞培養(yǎng)，實驗樣品的 、保存、 ，丙型肝炎 檢測 的室內(nèi)質(zhì)量 及能力驗證和 生物安全。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展日新月異，新理論、新觀點、新的 技術(shù)和防治策略不斷出現(xiàn)，中國疾病預(yù)防 中心將適時組織 對規(guī)范進行修改和更新。主要起草 ： 疾病預(yù)防 中心 預(yù)防 中心。參加編寫 ： 疾病預(yù)防 中心 預(yù)防 中心、 疾病預(yù)防 中心 病預(yù)防 中心、 醫(yī)學部、 人民醫(yī)院、上海 研究所、藥品生物制品檢定所、浙江大學醫(yī)學院、市疾病預(yù)防中心。編寫組：、福、蔣巖、 、 、 。適用于全國所有的丙

6、型肝炎 檢測 。解釋權(quán)屬于 疾病預(yù)防 中心。自發(fā)布之日起施行。丙型肝炎 檢測技術(shù)規(guī)范編寫組2011年1月20日 于第一章 丙型肝炎丙型肝炎 （HCV）于 被正式命名，在此之前被稱為腸道外傳播的 非乙型肝炎。1991 年被黃科（Flaviviridae）。雖然丙型肝炎作為疾病早已被發(fā)現(xiàn)，但直到 2005 年 HCV 體外細胞培養(yǎng)才獲得。這對進一步認識 HCV 結(jié)構(gòu)與功能、深入研究 HCV 的發(fā)病機制、研究和開發(fā)抗 HCV 和 具有重要意義。1. 形態(tài)和基因組結(jié)構(gòu)HCV 是一種有包膜的 RNA 。體為直徑 4060nm 的球狀顆粒，包膜表面有刺突結(jié)構(gòu)。用 提取去除包膜后，可 其中心的核衣殼，直徑約

7、 33nm。經(jīng)蔗糖梯度離心后，血清中的 HCV 顆粒分布于 3 個組分：浮密度為 1.041.06g/ml 者為與血清中脂蛋白結(jié)合的 顆粒；1.091.1g/ml 者為游離的顆粒；浮密度為 1.171.24g/ml 的顆粒與血清中抗體結(jié)合以免疫復(fù)合物形式 。在學上HCV屬黃 科（Flaviviridae）丙型肝炎 屬（Hepaci ）。HCV是單股正鏈RNA，基因組總長約9.6kb，編碼單一的開放讀框（open ing frame，ORF），可翻譯成一個約3000個氨基酸的前體蛋白。在HCV ORF兩側(cè)分別有一個5非編碼區(qū)和3非編碼區(qū)，均具有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)。5非編碼區(qū)含有內(nèi)部核糖體進入位點（i

8、nternal ribosome entry site，IRES），可直接與40S核糖體亞結(jié)合，啟動HCV前體蛋白的翻譯。翻譯啟動后首先產(chǎn)生HCV前體蛋白。由宿主細胞的信號蛋白酶和HCV自身編碼的蛋白酶10個成熟的HCV編碼蛋白。HCV結(jié)構(gòu)蛋白位于前體蛋白的氨基末端1/3處，由宿主細胞的信號蛋白酶，蛋白（core）、2個包膜糖蛋白（E1、E2）和一個小的p7蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）位于前體蛋白的羧基末端2/3處， NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，其 由HCV自身編碼的蛋白酶介導，其中NS2-3自身蛋白酶切割NS2和NS3 間的連接，而NS3絲氨酸蛋白酶負責下游NS3至N

9、S5B間的成熟（圖1）。43圖1HCV基因組結(jié)構(gòu)及 蛋白注： 數(shù)字代表各成熟蛋白的第一位氨基酸殘基位置；細箭頭所指處由宿主細胞的信號蛋白酶切割；實心粗箭頭所指處由HCV NS2-3自身蛋白酶切割；空心粗箭頭所指處由HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶切割。其中NS3-4A間的連接為順式切割，而NS4A-NS5B為反式切割。2. 基因型依據(jù)基因序列的差異，可將 HCV 分為 6 個主要基因型及不同亞型，按照國際通行的方法，以數(shù)字表示 HCV 基因型，以小寫的英文字母表示基因亞型（如 1a、2b、3c 等）。基因 1-3 型呈全球性分布，其中 1a 和 1b 占所有 HCV 的 60%以上。歐洲、美洲

10、和亞洲的流行株以 1 型和 2 型為主；3 型主要流行于東南亞地區(qū)；4 型主要流行于中東地區(qū)；南非以 5 型和 6 型為主。我國以 1b 和 2a 基因型較為常見，但以 1b 型為主；某些地區(qū)有 1a、2b、3b 和 6a 型的。3. 和細胞嗜性HCV主要 肝細胞。首先，HCV與靶細胞表面的受體結(jié)合，進入細胞后脫殼將其基因組RNA 到細胞漿中。在HCV5非編碼區(qū)內(nèi)的IRES指導下，HCV基因組RNA可 使RNA被翻譯為一個大的前體蛋白，后者經(jīng)宿主細胞和HCV自身編碼的蛋白酶 成為成熟的HCV基因產(chǎn)物，其中NS3到NS5B可組成HCV的 復(fù)合體，以HCV基因組RNA為模板， 啟動負鏈HCV RN

11、A的。新 的負鏈HCV RNA又可作為模板進行新正鏈及新負鏈HCV RNA的 ，其中一些正鏈HCV RNA可包裝成為子代，經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運系統(tǒng)到細胞外（圖2）。圖 2HCV 周期示意圖4. 致病性和免疫性丙型肝炎的潛伏期為226周，平均約67周。多數(shù)（約80%）HCV 者無癥狀或僅有輕微癥狀，如疲勞、食欲減退、右上腹部不適、搔癢等，黃疸很少見（20%）。50% 80%的患者可發(fā)展成慢性丙型肝炎。有些患者不出現(xiàn)癥狀，發(fā)病慢 染，慢性丙型肝炎的表現(xiàn)輕重不等。約20%的慢性丙型肝炎患者可在20年內(nèi)發(fā)展為肝硬化，一旦到肝硬化階段，每年約有1%7%可進展為原發(fā)性肝細胞癌。我國約10%肝癌患者血中 抗-HC

12、V。目前丙型肝炎尚無有效 可以預(yù)防，切斷傳播途徑尤其是 血液傳播仍是最主要的預(yù)防措施。丙型肝炎的標準治療 是-干擾素和 林聯(lián)合治療，有助于盡早從血液和肝臟中清除HCV，并使患者的血液生化學指標及組織學改變恢復(fù)正常。人HCV后，可呈現(xiàn)四種類型的抗-HCV反應(yīng)：（1）輸入抗-HCV反應(yīng)。多見于輸入含高滴度抗-HCV血液者，輸血后抗-HCV即為陽性，5周后陰轉(zhuǎn)，而后 者自身產(chǎn)生抗-HCV，并可持續(xù) 。（2）遲發(fā)性抗-HCV持續(xù)陽性反應(yīng)。于輸血后2022周或發(fā)病后1416 -HCV陽轉(zhuǎn)，并迅速達高水平，可持續(xù)陽性10年以上。（3）遲發(fā)性抗-HCV短期陽性反應(yīng)。于輸血后1921周或發(fā)病后911 -HCV

13、陽轉(zhuǎn)，但1年后轉(zhuǎn)陰。（4）無反應(yīng)。此種反應(yīng)多見于一過性HCV 者或免疫力低下者，抗-HCV始終 。目前多認為，HCV感染所致肝臟損傷主要來自機體對HCV的免疫應(yīng)答。此外，有研究顯示，HCV的 蛋白可通過損傷線粒體功能，引起肝細胞氧化應(yīng)激，間接導致肝細胞損傷。HCV 者大約有25%能自動清除體內(nèi) 。有證據(jù)表明，這是機體產(chǎn)生了較強的體液和細胞免疫應(yīng)答所致，HCV 后的轉(zhuǎn)歸被認為與細胞免疫 更為密切。丙型肝炎患者康復(fù)后，僅有較低免疫力，可再次被同種或異種HCV株所 。也有同一患者 多種基因型HCV的 。第二章 丙型肝炎抗體檢測1. 概述本章規(guī)定了丙型肝炎抗體的檢測 、程序、結(jié)果報告、檢測策略。可作為

14、對 HCV者篩查、 和流行病監(jiān)測的依據(jù)。2. 抗-HCV 檢測的目的意義2.1 抗-HCV 檢測可用于、血液篩查、流行病監(jiān)測等。2.2 以為目的的檢測是為了確定個體 HCV 狀況。，2.3 以血液篩查為目的的檢測是為了防止輸血傳播 HCV 獻血員篩查和原料血漿篩查。2.4 以流行病監(jiān)測為目的的檢測是為了解不同人群 HCV 率及其變化趨勢， 各類高危人群、重點人群和 人群。3. 抗-HCV 檢測的抗-HCV 檢測分為篩查試驗（酶聯(lián)免疫吸附試驗、膠體金法快速試驗、化學發(fā)光試驗、免疫熒光試驗）和補充試驗（免疫印跡試驗）。3.1 篩查試驗3.1.1 抗-HCV 酶聯(lián)免疫吸附試驗間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗是

15、抗-HCV 檢測常用的篩查。其基本原理是以 HCV 抗原包被固相載體，用辣根過氧化物酶標記的抗人 IgG 與被檢樣品中的抗-HCV 反應(yīng)，以鄰苯二胺（OPD）或 3，3，5，5四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等底物顯色后，利用酶標儀等儀器進行陰陽性結(jié)果 。其主要反應(yīng)過程如下：加入經(jīng)樣本稀釋液稀釋的被檢樣品，樣品中的抗-HCV 與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物；固相載體上只留下抗-HCV，其他免疫球蛋白及樣品中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去；加酶標抗抗體與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標記上酶；洗滌后，固相載體上的酶量就顯示特異性抗體的量；加底物顯色及終止液，利用酶標儀等儀

16、器分析結(jié)果。3.1.2 化學發(fā)光試驗化學發(fā)光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和等的檢測分析技術(shù)。化學發(fā)光免疫分析法以標記的不同而分為兩種：（1） 化學發(fā)光標記免疫分析法：化學發(fā)光標記免疫分析又稱化學發(fā)光免疫分析（CLIA）， 是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析 。常用于標記的化學發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物acridiniumester（AE），是有效的發(fā)光標記物，通過起動發(fā)光試劑作用而發(fā)光， 強烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成，為快速

17、的閃爍發(fā)光。吖啶酯作為標記物用于免疫分析，其化學反應(yīng)簡單、快速、無須催化劑；檢測小分子抗原采用競爭法，大分子抗原則采用夾心法， 非特異性結(jié)合少，本底低；與大分子的結(jié)合減小所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度。（2） 化學發(fā)光酶免疫分析法：從標記免疫分析角度，化學發(fā)光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay，CLEIA）應(yīng)屬酶免疫分析，只是反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，操作步驟與 ELISA 分析完全相同。以酶標記生物活性物質(zhì)（如酶標記的抗原或抗體）進行免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定。該 又分為如下幾類：

18、。 HRP 標記的 CLEIA：常用的底物為或其衍生物如異 ，是一類重要的發(fā)光試劑 的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進行，在過氧化物酶及活性氧（過氧化陰離子O2-，單線態(tài)氧 O2，羥 基 OH-，過氧化氫 H2O2）下生成激發(fā)態(tài)中間體，當其回到基態(tài)時發(fā)光，其波長為 425nm。早期用直接標記抗原或抗體，但標記后發(fā)光強度降低而使靈敏度受到影響。近來用過氧化物酶標記抗體，進行免疫反應(yīng)后利用 作為發(fā)光底物， 在過氧化物酶和起動發(fā)光試劑（NaOH2H2O2）作用下， 發(fā)光，發(fā)光強度依賴于酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度。 增強發(fā)光酶免疫分析（enhanced luminescence enzyme immunoassa

19、y，ELEIA）在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強發(fā)光劑以增強發(fā)光信號， 并在較長時間內(nèi)保持， 便于重復(fù)測量， 從而提高分析靈敏度和準確性。 ALP 標記的 CLEIA所用底物為環(huán) 1，22 二氧乙烷衍生物，用于化學發(fā)光酶免分析底物而設(shè)計的分子結(jié)構(gòu)中包含起 作用的基團烷基，其分子中發(fā)光基團為芳香基團和酶作用的基團，在酶及起動發(fā)光試劑作用下引起化學發(fā)光。3.1.3 膠體金法快速試驗（1） 免疫滲濾試驗：斑點免疫膠體金快速試驗以硝酸纖維膜為載體，HCV 抗原點狀固定在膜上，加待檢樣品。陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。反應(yīng)時間在 10 分鐘以內(nèi)。有效試驗的質(zhì)控點必須顯色。（2） 免疫層析試驗：以硝酸纖維膜為

20、載體，HCV 抗原線狀固定在膜上，待檢樣品沿著固相載體遷移，陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗的質(zhì)控線必須顯色。3.2 抗體補充試驗抗體補充試驗?zāi)壳俺Ｓ玫臑槊庖哂≯E試驗。免疫印跡法試劑將HCV不同編碼區(qū)抗原多種成分噴涂在硝酸纖維薄膜條上，并設(shè)置了兩種不同濃度的人IgG對照帶和一條hSOD 對照帶，用于內(nèi)部對照和結(jié)果 。其 HCV 的敏感性高、特異性強，可檢測 HCV不同編碼區(qū)抗原的抗體，且不需要特殊的儀器。4. 抗-HCV 檢測策略及結(jié)果報告4.1 監(jiān)測相 檢測策略及結(jié)果報告先用篩查試劑-1 進行初篩試驗，結(jié)果呈反應(yīng)，報告“抗-HCV ”，不再進行復(fù)檢試驗；結(jié)果呈陽性反應(yīng)，進入復(fù)檢

21、試驗。所有初篩陽性反應(yīng)的樣品使用篩查試劑-2 進行復(fù)檢，結(jié)果呈反應(yīng)，報告“抗-HCV ”；結(jié)果呈陽性反應(yīng)，報告“抗-HCV 陽性”。HCV 報告檢測流 3。初篩試驗樣品反應(yīng)復(fù)檢試驗陽性反應(yīng)篩查試劑-1報告抗-HCV 陽性篩查試劑-2報告抗-HCV反應(yīng)陽性反應(yīng)圖 3 HCV 報告的檢測流程4.2 臨床 相 檢測策略及結(jié)果報告4.2.1 篩查試驗用篩查試劑進行初篩，結(jié)果呈反應(yīng)，報告“抗-HCV ”；結(jié)果呈陽性反應(yīng)，不能出具陽性報告，必須進入復(fù)檢試驗。對初篩呈陽性反應(yīng)的樣品用原有試劑雙孔或原有試劑加另一種不同原理（或廠家）試劑進行復(fù)檢試驗，如均呈反應(yīng)，報告“抗-HCV ”； 如均呈陽性反應(yīng)或一反應(yīng)，

22、進行補充試驗。臨床 篩查檢測流4。初篩試驗樣品篩查試劑反應(yīng)復(fù)檢試驗陽性反應(yīng)一原有試劑雙孔或原有試劑加另一種不同原理（或廠家）試劑均反應(yīng)報告抗-HCV補充試驗均陽性反應(yīng)圖 4 臨床篩查檢測流程4.2.2 補充試驗4.2.2.1 臨床 補充試驗 -1復(fù)檢試驗陽性反應(yīng)樣品，進行免疫印跡試驗。結(jié)果者，報告“抗-HCV ”；結(jié)果陽性者，報告“抗-HCV 陽性”；結(jié)果不確定者，報告“抗-HCV 不確定”，并進行隨訪。臨床 補充試驗檢測 一流 5。4.2.2.2 臨床 補充試驗 -2此 僅限于檢測/試劑給出了特定閾值（與抗體補充試驗比較，其陽性的值95）時使用。高 S/CO 比值：當 S/CO 比值特定的閾

23、值時；低 S/CO 比值：其 S/CO 比值特定的閾值。初篩和復(fù)檢均為陽性，且有樣品 OD 值與臨界值（Cutoff）的比值（S/CO）試劑說明低 S/CO 值復(fù)檢陽性樣品書中給出的特定閾值，可報告“抗-HCV 陽性”,無需再做免疫印跡試驗；否則，還應(yīng)進一步作免疫印跡試驗。免疫印跡試驗結(jié)果陽性者，報告“抗-HCV 陽性”；結(jié)果不確定者，報告“抗-HCV 不確定”并進行隨訪。臨床補充試驗檢測二流 6。陽性反應(yīng)不確定免疫印跡試驗報告抗-HCV 不確定報告抗-HCV報告抗-HCV 陽性反應(yīng)圖 5 臨床補充試驗檢測 -1 流程初/復(fù)檢陽性樣品根據(jù) S/CO 值不確定免疫印跡試驗報告抗-HCV 陽性陽性

24、反應(yīng)高 S/CO 值反應(yīng)報告抗-HCV報告抗-HCV 不確定圖 6 臨床補充試驗檢測 -2 流程4.3 血液篩查相 檢測策略及結(jié)果報告獻血/漿員體檢合格后抽血檢驗。用抗體篩查試劑進行初篩，結(jié)果呈陽性反應(yīng)，報告“抗-HCV陽性待查”，獻血/漿員暫停獻血，如果需要進一步獻血/漿員 狀況，執(zhí)行臨床策略；結(jié)果呈 反應(yīng)，報告“抗-HCV初篩”，獻血/漿員獻血，進入復(fù)檢試驗。對初篩呈反應(yīng)的樣品用另一種抗體篩查試劑進行復(fù)檢試驗。如呈 反應(yīng)，報告“抗-HCV ”，血液供應(yīng)臨床；如呈陽性反應(yīng)，則報告“抗-HCV陽性待查”，血液報廢，如果需要進一步 獻血/漿員狀況，執(zhí)行臨床 策略。血液篩查檢測流 7。初篩試驗樣品

25、陽性反應(yīng)反應(yīng)抗體篩查試劑另一種抗體篩查試劑報告抗-HCV 陽性待查報告抗-HCV陽性反應(yīng)反應(yīng)復(fù)檢試驗圖 7 血液篩查檢測流程5. 檢測結(jié)果的解釋抗-HCV篩查結(jié)果補充試驗結(jié)果報 告解 釋篩查試驗不需檢測抗-HCV未HCV，除非懷疑最近被或其它證據(jù)提示HCV?？赡芴崾炯韧颥F(xiàn)在了 HCV；未篩查試驗陽性，且 S/CO 比值高不需檢測抗-HCV 陽性做血清學補充試驗。高 S/CO 比值的樣品常被確證為陽性（95），但尚有1）重測抗-HCV 或 HCV RNA。第三章 丙型肝炎抗原檢測1. 概述本章規(guī)定了 HCV 抗原檢測的和用途。 適用于對人血液標本中抗原的檢測。2. HCV 抗原檢測的目的意義2

26、.1 HCV血清陽轉(zhuǎn)前的早期急性丙型肝炎輔助，尤其有助于HCV 窗口期患者、抗-HCV檢測結(jié)果不確定患者或HCV陽性母親所生嬰兒是否罹患丙型肝炎的輔助 ；2.2 免疫受損或先天性免疫缺陷群體如HIV 者、長期透析的腎病患者、器官移植患者或先天性免疫功能缺陷患者等HCV的篩查；2.3 抗-HCV陽染者的血癥分析；2.4 HCV 者治療前后 血癥追蹤分析。3. HCV 抗原檢測的目前抗原檢測ELISA試劑采抗體夾心法定性或定量檢測樣品中游離的HCV 抗原或總抗原（抗原抗體復(fù)合物和游離 抗原）。其基本原理是：以基因工程抗原免疫小鼠后所獲得的純化抗-HCV抗原單克隆抗體作為固相包被物，用與固相包被物有

27、不同抗原決定簇的抗-HCV抗原單克隆抗體作為辣根過氧化物酶標記物，與樣品中總的或游離的HCV 抗原反應(yīng)，OPD顯色后進行定性或定量測定。大部分 HCV 抗原檢測試劑檢測的是樣品中游離抗原以及和抗-HCV 結(jié)合的抗 此在進行檢測之前需要加入尿素、鹽酸及去垢劑等，以解離樣品中的 抗原- 抗體免疫復(fù)合物。其它操作程序與的 ELISA 或發(fā)光技術(shù)操作基本相同，即：第一入待測樣品，孵育后，洗去未結(jié)合的成分，加入酶標記或發(fā)光物質(zhì)的抗抗原的二抗，孵育后顯色，再加入終止液終止顯色，用酶標儀比色計算 s/co 值，來進行和陽性反應(yīng)的。將 HCV 抗原的標準物質(zhì)稀釋成不同濃度的系列標準，還可進行 HCV 抗原的定

28、量檢測。以橫坐標為 HCV 抗原的濃度（pg/ml ），縱坐標為 OD 值，繪制出標準曲線。測出待測樣品的 OD 值以后，在標準曲線上查出抗原的濃度。如果待測樣品的 OD 值超出標準曲線上最高抗原濃度的 OD 值，則需用血清將樣品稀釋以后再行檢測。4. 檢測策略及結(jié)果報告初次檢測抗原樣品，報告為“HCV 抗原”；初次檢測抗原陽性反應(yīng)樣品，需要雙孔復(fù)檢。如果雙孔復(fù)檢結(jié)果均為 ，報告為“HCV 抗原”；如果雙孔檢測結(jié)果至少有一孔結(jié)果為陽性反應(yīng)，則報告為“HCV 抗原陽性”。5. 檢測結(jié)果的解釋5.1 結(jié)果的解釋由于目前抗原檢測試劑的靈敏度較低，最靈敏的檢測試劑只能達到相當于 500 IU/ml 水

29、平的 HCV RNA，因此的結(jié)果并不能排除 HCV 現(xiàn)癥的可能。5.2 陽性結(jié)果的解釋現(xiàn)階段，HCV 抗原陽性僅作為 HCV 的輔助 依據(jù)，不能據(jù)此確診。特別是對處于“灰區(qū)”的陽性結(jié)果，需要結(jié)合臨床表現(xiàn)及 HCV RNA、抗-HCV 等檢測結(jié)果來解釋。監(jiān)測病程進展或抗 治療效果應(yīng)進行 HCV 抗原的定量檢測。第四章 丙型肝炎核酸檢測1. 概述本章規(guī)定了 HCV 核酸檢測的、用途及結(jié)果判定標準。 適用于對人血液樣品中 HCV核酸的檢測。2. HCV 核酸檢測的目的意義2.1 HCV RNA 定性檢測可用于血液篩查領(lǐng)域?？墒褂脝畏輼悠坊蛘叨鄻悠芳系?，對獻血員血液及 血漿站的原料血漿進行核酸檢測，

30、降低輸血殘余風險度。2.2 HCV RNA 定性檢測可用于對 HCV 抗體的高危人群樣品進行集合核酸檢測，及時發(fā)現(xiàn)窗口期 。2.3 HCV RNA 定量檢測的意義主要體現(xiàn)在作為抗治療療效的指標，指導抗 治療及療效判定。3. HCV 核酸檢測的，丙型肝炎 核酸檢測主要 HCV RNA 定性、定量檢測及 HCV 基因型檢測。目前， HCV RNA 檢測主要依賴于 PCR 技術(shù) 定性 PCR 檢測和定量 PCR 檢測，在我國臨床實驗室以 TaqMan 熒光定量PCR 占主導地位；與此同時，也有其他不同于 PCR 的性能優(yōu)良的核酸檢測技術(shù)，如分支 DNA 技術(shù)（ branched DNA， bDNA）

31、和轉(zhuǎn)錄介導的擴增技術(shù)（transcription-mediated amplification，TMA）等與 PCR 并行。試劑必須是經(jīng)過食品藥品監(jiān)督管理局 ，在有效期內(nèi)的試劑。應(yīng)根據(jù)試劑使用說明書中規(guī)定的目的和范圍選擇使用試劑。3.1 RT-PCR 檢測技術(shù)傳統(tǒng) PCR 定性檢測 HCV RNA 需要三個步驟：對待測樣品進行處理：通過裂解、純化，提取樣品中的 HCV RNA 作為 PCR 擴增的模板；采用逆轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-PCR）技術(shù)對提取到的 HCV RNA 進行擴增；檢測 PCR 擴增產(chǎn)物，檢測凝膠電泳和 PCR-酶聯(lián)免反應(yīng)（PCR-ELISA）等。3.2 TMA 檢測技術(shù)TMA 是

32、一種利用 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和 T7 RNA 聚合酶 2 種酶的共同作用，在等溫條件下來擴增 RNA 的反應(yīng)系統(tǒng)。TMA 使用的引物含有 T7 RNA 聚合酶結(jié)合位點，使得反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 可以作為 T7 RNA 聚合酶的模板，在 T7 RNA 聚合酶的作用下大量的 RNA 拷貝。擴增出來的 RNA 重新進入 TMA 循環(huán)，成為下一輪的模板。TMA 優(yōu)點在于特異性強、靈敏度高，反應(yīng)條件簡單、擴增只需一個溫度，無需專門的熱循環(huán)儀器，且因整個反應(yīng)在一個試管中進行，擴增產(chǎn)物 RNA 易于降解，從而大大減少了污染的可能。基于 TMA 技術(shù)的VERSANT HCV RNA 定性檢測可檢測到極低水平

33、的HCV RNA，甚至可低至 5IU/ml。3.3 實時熒光定量 PCR 技術(shù)熒光定量 PCR 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET） 的原理，當某個熒光基團的發(fā)射譜與另一熒光基團的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個基團距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到長波長（低能量）的熒光基團，這個過程稱為 FRET?；?FRET 原理，出現(xiàn)了不同種類的熒光 PCR，主要體現(xiàn)在探針設(shè)計的不同，如 TaqMan 探針、分子信標和熒光雜交探針。以目前我國應(yīng)用最廣泛的 TaqMan 熒光標記探針的定量 PCR 為例，是在探針（p

34、robe）的兩端偶聯(lián)一個短波長的熒光基團（報告基團）和一個長波長的熒光淬滅基團，這兩個基團位置靠近，熒光基團不發(fā)熒光；Taq 酶在發(fā)揮 53方向聚合酶活性的同時，還具有 53方向的外切酶活性，可使探針降解，熒光淬滅基團從而解離、遠離熒光基團，熒光基團發(fā)出熒光，熒光的強度與 PCR 產(chǎn)物的量相關(guān)， 通過計算可得出具體的量值。熒光定量 PCR 檢測 HCV RNA 的操作程序：RNA 提取、PCR 擴增、熒光檢測及結(jié)果分析。目前的熒光定量 PCR 儀都帶有相應(yīng)的分析，輔助設(shè)定閾值及 Ct 值，也允 在合理的范圍內(nèi)自行調(diào)整。一個良 PCR 反應(yīng)反映到標準曲線上，就是標準曲線的相關(guān)性良好（r2 通常要

35、0.99），斜率（反映擴增的效率）在指定的范圍內(nèi)。但采用外標法定量的試劑盒標準品擴增良好也不一定意味著樣品一定擴增良好，因為還涉及 RNA 提取質(zhì)量的問題，因此特別要注意考察陽性質(zhì)控和質(zhì)控的結(jié)果 結(jié)果必須沒有擴增曲線， 而陽性質(zhì)控必須擴增曲線良好，結(jié)果落入指定的區(qū)間內(nèi)。3.4 b-DNA 技術(shù)分支 DNA（bDNA）技術(shù)基于其獨特的信號放，即 bDNA 信號放，這是一個人工 的 bDNA，bDNA 的分枝可結(jié)合多個酶標記物，從而將的信號放大，以便進行檢測。利用序列特異的寡聚核苷酸探針雜交捕捉HCV RNA，HCV RNA 隨后與支鏈DNA（bDNA）二級探針雜交，bDNA 再與酶聯(lián)三級探針結(jié)合

36、，隨后加入酶底物，產(chǎn)生的化學發(fā)光信號強度與靶 RNA 的量成正比。操作程序 ：首先將血漿樣品離心，濃縮其中的顆粒，HCV RNA 后加入微孔板中，板包被有可與特異結(jié)合的一系列靶探針，另一系列靶探針的一端可標記在游離的核酸鏈上，另一端可與 bDNA 結(jié)合，加入酶標記物對結(jié)合的 bDNA 進行標記， 經(jīng)過 后加入底物進行反應(yīng)，測定反應(yīng)強度。本定量系統(tǒng)中沒有內(nèi)標記物，每次實驗設(shè)置一系列外部標記，通過實驗樣品反應(yīng)強度與外部標記樣品強度的比較確定實驗樣品的病毒拷貝數(shù)。由于此實驗不涉及核酸擴增過程，因此全部操作可在同一區(qū)域內(nèi)進行，對此區(qū)域的要求相對較低，但應(yīng)保證此區(qū)域內(nèi)不含有與本實驗?zāi)康幕蛳嗤拇罅亢怂?/p>

37、擴增產(chǎn)物或克隆產(chǎn)物。試驗區(qū)應(yīng)配置 2 個箱（在使用前分別調(diào)至 37和 63）、高速恒溫離心機和bDNA 測定分析儀。4. 檢測策略及結(jié)果報告4.1 HCV 核酸定性檢測用于血液篩查策略及結(jié)果報告對血液抗-HCV 初篩呈反應(yīng)的樣品可用集合 NAT（Pooling NAT）進行復(fù)檢試驗。如呈陽性反應(yīng)，做單人份 NAT 檢測，陽性結(jié)果報告“陽性待查”，血液報廢，如果需要進一步 獻血/漿員狀況，執(zhí)行臨床策略；如呈反應(yīng)，報告“HCV 復(fù)檢”， 血液供應(yīng)臨床。初篩試驗樣品陽性反應(yīng)復(fù)檢試驗反應(yīng)抗體篩查試劑陽性反應(yīng)NAT報告陽性待查反應(yīng)報告 HCV圖 7 HCV 核酸定性檢測用于血液篩查流程4.2 HCV 核

38、酸定性檢測用于臨床策略及結(jié)果報告抗-HCV 復(fù)檢試驗陽性反應(yīng)樣品，進行定性 NAT 試驗。結(jié)果陽性者，報告“HCV 陽性”； 定性 NAT 結(jié)果的樣品，須做免疫印跡試驗確證。檢測流 8。免疫印跡試驗陽性反應(yīng)反應(yīng)核酸定性檢測報告 HCV 陽性報告不確定不確定報告 HCV報告 HCV 陽性陽性反應(yīng)反應(yīng)圖 8 HCV 核酸定性檢測用于臨床流程4.3 HCV 核酸定量檢測用于臨床治療策略及結(jié)果報告現(xiàn)階段對HCV RNA定量檢測的尚未完全統(tǒng)一，有的報告拷貝/ml，有的報告國際單位IU/ml，不同的試劑所用的標準不一樣，造成IU和拷貝之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)不同。國產(chǎn)HCV RNA定量檢測試劑盒的檢測范圍 在103

39、108拷貝/ml。HCV RNA 定量檢測報告單應(yīng)該具備如下內(nèi)容：檢測（如熒光定量 PCR）、檢測試劑名稱、 及檢測范圍。臨床樣品的結(jié)果報告可能有幾種情況：結(jié)果在檢測范圍內(nèi)，則按檢測的結(jié)果直接發(fā)報告，如每毫升 3.2105 拷貝/ml（有的臨床表示為 3.20E+05 拷貝/ml）；結(jié)果高于檢測上限，則應(yīng)用 HCV 的混合血漿（清）將樣本進行 101000 稀釋后再重新進行檢測， 直到結(jié)果落入檢測范圍內(nèi)；樣本未出現(xiàn)擴增曲線，則報告為低于檢測下限。如果低于檢測下限，但又有擴增曲線出現(xiàn)，則應(yīng)重新進行檢測，若在檢測限內(nèi)，按照實際數(shù)發(fā)報告，若仍低于檢測下限，則報告為“低于檢測下限”。目前很多 對這部分

40、樣品不進行復(fù)檢就直接發(fā)出報告，會造成相當部分陽性樣品的漏檢。5. 檢測結(jié)果的解釋抗-HCV篩查結(jié)果補充試驗結(jié)果報 告解 釋篩查試驗陽性NAT 陽性抗-HCV 陽性HCV RNA 陽性提示活動性 HCV 。篩查試驗陽性NAT抗-HCV，提示既往或現(xiàn)在抗-HCV 陽性HCV；由于某些 HCV 慢染的免疫印跡陽性篩查試驗陽性NAT免疫印跡NATHCV RNA 抗-HCV HCV RNA抗-HCV 不確定HCV RNA 間隙陽性，因此一次 HCV RNA結(jié)果不能排除活動染。未HCV?？?HCV 篩查結(jié)果可能是假陽性，在這種篩查試驗陽性免疫印跡不確定HCV RNA 情況下，提示未 HCV。第五章 丙型肝

41、炎基因型檢測1. HCV 基因型1993 年 Simmonds 等提出的分型得到了大多數(shù)學者的認同。Simmonds 等分析不同毒株編碼非結(jié)構(gòu)蛋白 5（NS5）區(qū)域核苷酸序列的同源性，按照發(fā)現(xiàn)的先后將 HCV 主要分為 16 個型，每個型有若干亞型，以 a，b，c 等表示。這樣，HCV 被分為 6 個型和 70 多個亞型。Simmonds 分型對臨床慢性丙型肝炎的抗 治療具有重要指導意義，肝病學會、歐洲肝病學會、亞太肝病學會和制定的系列丙型肝炎防治指南都采用了該法進行分型。在我國，最主要的基因型為 1b（66%），其次為 2a（14%），還有其他較少見的型別，如西南地區(qū)的 3 型和等地區(qū)的 6

42、 型等。2. HCV 基因型檢測與試劑傳統(tǒng)的HCV 血清學分型與分子生物學分型相比，只有 62.1%的符合率。現(xiàn)階段檢測 HCV基因型的分子生物學有限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、測序法及反向線性探針雜交法（reverse hybridization line probe assay，LiPA）等，目前商品化試劑盒所用的主要是后兩種。如 Bayer 的 Trugene HCV 分型試劑盒和 Inno-LiPA HCV 基因分型 2.0 試劑盒。分型試劑的檢測靶位點主要集中于保守的 5端非編碼區(qū)，Trugene HCV 分型試劑直接對 HCV RNA 序列測定來分型，LiPA 則是基于反向雜交

43、原理PCR 擴增目的基因（擴增的DNA 被生物素標記），與硝酸纖維膜上線形區(qū)帶上的寡核苷酸探針雜交，再加入標記有堿性磷酸酯酶的親和素，與雜交產(chǎn)物上標記的生物素結(jié)合，加入顯色底物 NBT/BCIP 孵育后，顯現(xiàn)紫色或棕色的條帶，不同的條帶組合對應(yīng)不同的基因型。相比第一代 ，二代 LiPA HCV 增加了區(qū)序列，可準確地區(qū)分 1a 和 1b 型，并可避免東南亞地區(qū)和我國南部地區(qū)較常見的 6c-6l 型被誤分為 1 型，但仍約有 8%的 2a 型易被 LiPA 誤判為 1a 型，而這兩種型別的HCV 的治療和預(yù)后均 較大差異。需要注意，不論是 Trugene 還是 LiPA，均要經(jīng)過 PCR 擴增，

44、對 HCV 混合進行分型時，不可避免會因不同型別 RNA 擴增效率不一造成的劣勢擴增毒株的漏檢。3. 直接測序法 HCV 分型操作程序隨著核酸測序技術(shù)的發(fā)展，直接測序分型成為目前具有推廣潛力的 HCV 基因型檢測方法。該需要對 HCV RNA 進行 PCR（nested PCR，亦稱套式 PCR）擴增，套式 PCR 是 PCR 衍生技術(shù)中最常用的，它使用兩對引物，進行兩次 PCR 反應(yīng)，能夠極大地增加PCR 擴增反應(yīng)的敏感性和特異性。套式 PCR 第二次反應(yīng)的引物（內(nèi)引物）位于第一次 PCR 擴增區(qū)域內(nèi)。外引物進行第一次 PCR 擴增后，將第一次 PCR 擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至第二次 PCR 反應(yīng)管內(nèi)

45、，使用一對內(nèi)引物進行第二次 PCR 擴增反應(yīng)，最后用凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物。之后對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化回收目的片段，然后測序。3.1 引物設(shè)計原則除遵循 PCR 引物設(shè)計的原則以外，HCV 分型主要考慮的是選擇哪一段基因組序列進行分型才能獲得更高的分辨效率。臨 用于 HCV 基因分型的有多種，最常用的是根據(jù) 5端非編碼區(qū)（5NCR）序列差異而進行的基因分型，如 INNO-LiPA、5NCR 序列的直接測序、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）-PCR 等，但基于 5NCR 的基因分型對不同亞型的分型準確率有較大的差異，對 1b、1a、2a、2b、2c、3a 亞型的分型準確率分別為 7

46、6%、91%、20%、50%和 96%，幾乎不能對 4a、4b 和 4c 亞型進行區(qū)分，總準確率僅有76%，這與 5NCR 序列過于保守有關(guān)。因為同一基因型、不同亞型 HCV5NCR 序列的差異度僅為 1.0%3.3%，而 NS5B 基因序列的差異度為 16.5%20.1%，NS5B 基因更適合用于HCV 的基因分型。列舉常用的 PCR 引物：外側(cè)引物：5-TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGA-3（上游引物）5-GGCGGAATTCCTGGTCATAGCCTCCGTGAA-3（下游引物）擴增的片段長度為401bp內(nèi)側(cè)引物：5-CTCAACCGTCACTGAGAGAGA

47、CAT-3（上游引物）5-GCTCTCAGGTTCCGCTCGTCCTCC-3（下游引物，測序引物）擴增的片段長度為339bp3.2 擴增體系引物各10100pmol/L4種dNTP（dATP、dTTP或dUTP、dCTP和dGTP）各200mol/L Taq DNA聚合酶12UMg2+1.52.0mmol/L模板DNA100ng2000g三蒸水加至50l3.3 PCR 條件42 60min，94 5min第 1 輪 PCR 條件為：94 2min94 30s，50 35s，682.5min，35 個循環(huán)68 9.5min。第 2 輪：取第 1 輪 PCR 產(chǎn)物 1l 作為模板，進行第 2 輪

48、 PCR，反應(yīng)條件與第 1 輪相同。3.4 切膠純化1%瓊脂糖凝膠電泳之后，對目的片段切割，回收及純化。測序，純化后的 DN段測序 由專業(yè)的測序公司幫助完成，目的片段大小在 500 600bp 以下可以單向測序，超過 500600bp 的需要雙向測序。3.5 結(jié)果分析根據(jù)序列，使用 BioEdit 進行基因親緣 分析并繪制系統(tǒng)進化樹，得到分型結(jié)果。4. HCV 基因分型的臨床意義不同基因型對抗 治療的應(yīng)答不同，采取的治療方案也不同，對RNA定量結(jié)果也有一定的影響?；蛐偷臏y定有助于決定抗 療程和劑量。根據(jù)臨床研究結(jié)果，在1型患者中，抗 治療的療程和 林的用藥劑量不同對持續(xù)學應(yīng)答（sustain

49、ed virologic response，SVR）有明顯的影響，建議療程為1年，林的用量要達到l000 l200mg/d，盡管如此，其持續(xù) 學應(yīng)答僅達到40%45；而2和3型患者，療程半年，利巴的用量只要800mg/d即可達到70%80的持續(xù)學應(yīng)答。延長療程或增加 林的用量都不能進一步提高SVR率。根據(jù)不同的基因型和患者肝臟病理學改變情況調(diào)整療程和 林的用藥劑量，可以減少不必要的浪費，同時減輕不良反應(yīng)，提高患者對治療的依從性。第六章 丙型肝炎細胞培養(yǎng)在體外細胞（尤其是細胞系）上的培養(yǎng)和擴增一直是 檢測的一個重要 之一。其操作過程就是將獲得的臨床樣品稍作處理或不作處理直接接種到嗜感性細胞里 將

50、會嗜感性細胞，并擴增產(chǎn)生 的子代 。由于已經(jīng)在細胞中進行了擴增，因此無論是蛋白還是核酸的檢測，其靈敏度和直接檢測臨床樣品相比會大大增加，而且擴增的可儲存， 必要可用于該 在分子學和病理學的進一步研究。但是細胞培養(yǎng)技術(shù)具有局限性，如體外細胞培養(yǎng)流程較長，不符合在緊急情況下的快速的要求；對實驗、生物安全級別和檢測操作技術(shù)的要求更高，因此產(chǎn)生的檢測費用更貴。目前已有多種丙型肝炎的細胞培養(yǎng)模型，如子模型，假模型和新近建立的基于 JFH-1 株的細胞 模型。但是到目前為止，這些細胞培養(yǎng)模型主要用于在 的科學研究，還不能應(yīng)用于臨床樣品的檢測。1. 丙型肝炎 的細胞培養(yǎng)模型1.1 丙型肝炎子模型分為亞基因組

51、子和全基因組子模型。其特點是在 HCV 基因組里一個抗性篩選標記，通過篩選來獲得一個能 HCV RNA 基因組的細胞系。絕大多數(shù)HCV 子的基因組里都含有幫助 HCV 基因組在體外細胞中的適應(yīng)性突變，但這些突變能破壞丙型肝炎 在體內(nèi)的 能力。丙型肝炎子模型是研究 HCV RNA 的重要工具，但是該系統(tǒng)只能產(chǎn)生 HCV 基因片段，不能獲得完整的 HCV 顆粒，并且由于該模型的建立需要大量的而且耗時長的分子生物學操作，因此還無法用到丙型肝炎 的臨床檢測。1.2 丙型肝炎 的假模型丙型肝炎 的假模型的原理是由HCV 的包膜蛋白E1 和 E2 來包裝帶有綠色熒光蛋白或者熒光素酶 的其它基因組（如 HI

52、V 或其它逆轉(zhuǎn)錄）。由此獲得的實際上是一個雜合 ：的外部由 HCV 的包膜蛋白組成，而的內(nèi)部由其它病毒組成。HCV 假能特異性地 肝細胞，并可通過檢測綠色熒光蛋白或者熒光素酶的表達來分析 的 力，因此該模型是研究丙型肝炎侵入宿主細胞的重要工具。和復(fù)制子模型一樣，丙型肝炎 的假 模型的建立需要復(fù)雜的分子生物學操作。假顆粒系統(tǒng)雖然能形成假 HCV 顆粒，但顆粒的 性很低，且蛋白表達水平極不 。目前還無法應(yīng)用到丙型肝炎 的臨床檢測。1.3 丙型肝炎 細胞 模型2005年 科學家Takaji建立了丙型肝炎 細胞 模型。從一個爆發(fā)性丙型肝炎患者體內(nèi)分離到一株基因型2a的HCV 株JFH-1。當轉(zhuǎn)染JFH-1全基因組