一種新型ATP―依賴型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP

1、一種新型AT-依賴型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP 摘要：運用基因克隆技術(shù)，以分離鑒定獲得的蛋白水解 酶高活性類芽胞桿菌(Paenibacilluslautus)CHN26菌株的基因組DNA為模板，經(jīng)克隆鑒定該菌株是一種新型ATP依賴型 ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因，全長585bp,編碼194個氨基酸，分子量約為21ku。采用大腸桿菌(Eschericiacoli)pET表達系統(tǒng)構(gòu)建PlclpP基因表達質(zhì)粒pET-28-PlclpP,并在大腸桿菌BL21中實現(xiàn)了重組PlClpP蛋白的表達。利用組氨酸標簽(His-tag)親和純化法獲得PlClpP純化蛋白，發(fā)現(xiàn) PlClpP可能與

2、宿主菌未知伴侶分子形成蛋白復(fù)合物。PlClpP 復(fù)合物具有ATP依賴型酪蛋白水解酶活性， 最適反應(yīng)溫度為40C、pH值7.0。表面活性劑強烈抑制PlClpP復(fù)合物的酶 活性，而常規(guī)絲氨酸蛋白酶抑制劑對其活性沒有抑制作用。 本研究結(jié)果為蛋白酶新基因資源的開發(fā)、ClpP家族蛋白酶的 基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：ClpP家族蛋白水解酶；類芽胞桿菌；基因；克??；表達；酶學(xué)特性 中 圖 分 類 號 ：Q789文 獻 標 志 碼 ：A文 章 編 號 ：1002-1302(2016)05-0047-04 蛋白水解酶約占全球酶制劑市場的60%,被廣泛應(yīng)用于 食品、醫(yī)藥、洗滌劑、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域1。微生物

3、是水解酶的主 要來源，探索并開發(fā)微生物新基因資源，對于解決目前商品化酶制劑種類及來源較少、底物單一、價格昂貴等問題具有重要意義。 ClpP(caseinolyticpeptidase)家 族ATP依 賴 型 伴 侶 分 子 相 連(chaperone-linked)的酪蛋白水解肽酶廣泛存在于原核生物及真核生物中2,其利用ATP驅(qū)動蛋白底物解折疊并轉(zhuǎn)位進入蛋白水解腔(chamber)中降解成小分子肽3。1988年，ClpP蛋白酶首次被發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌(Eschericiacoli)中4。此后的大量研究表明，大腸桿菌中ClpP蛋白酶(EcClpP)由蛋白水解核心ClpP、依賴ATP的伴侶分子ClpA

4、或ClpX組成，其蛋白水解腔由催化位點序列形成的2個反向同型七聚 體環(huán)構(gòu)成2。在國外，ClpP蛋白酶已商品化，而目前國內(nèi)尚無涉及ClpP家族蛋白酶的研究報道。止匕外，有關(guān)類芽胞桿菌屬(Paenibacillusspp.)中clpP基因功能的研究國內(nèi)夕卜均無報道。 采用基因克隆技術(shù)，以筆者所在實驗室分離鑒定獲得的蛋白水解酶高活性類芽胞桿菌(Plautus)CHN26菌株基因組DNA為模板，克隆鑒定了該菌株的一種新型ATP依賴型 ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因，并在大腸桿菌BL21中實現(xiàn)了異源表達。本研究結(jié)果為ClpP家族蛋白酶的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。 1材料與方法 1.1 試驗材

5、料 MiniBEST細菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PremixExTaqVerision2.0T4DNAligase均購自寶生物工程（大連）有限公司。限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和Hindm 購自Promega（美國）公司，Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。卡那霉素、氨節(jié)青霉素、聚丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺等SDS-PAG琪劑、蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒均購自生工生物工程（上海）有限公司。蛋白裂解試劑BugBusterProteinExtraction純化試劑Ni-NTAHis?Bindresin均購自MerckMillipore（德國）公司。B

6、-酪蛋白購自Sigma-Aldrich（美國）公司。 大腸桿菌TOP1O大腸桿菌BL21、基因克隆載體pGM-T（Ampr）均購自天根生物技術(shù)有限公司；基因表達載體 pET-28a（Kmr）購自MerckMillipore（德國）公司；類芽胞桿菌CHN26由筆者所在實驗室分離鑒定并保存。 1.2 試驗方法 1.2.1 分子生物學(xué)方法采用Primer5.0軟件（http:“ 下游引物ClpP-P1f（5-ATGGAGGATGAAACCATGAA-3、ClpP-P1r（5-TCACAGTTTGGTGACGATGT-3,以及在5端分別引入限制性核酸內(nèi)切酶BamHI、Hindin酶切位點（以 下劃線表

7、示）的上、下游引物ClpP-P2f（5-CGGGATCCATGGAGGATGA-3、ClpP-P2r(5 -CCCAAGCTTCAGTTTGGTGAC-3。寡核昔酸引物合成、DNA 序列測定由生工生物工程 （上海） 有限公司完成， 基因組和質(zhì)粒DNA的提取參照試劑盒說明書完成。 參考Shi等的方法5進行PCR反應(yīng)、產(chǎn)物純化、酶切、DNA片段連接與轉(zhuǎn)化、 菌落PCR檢測等。采用Clustal2.1軟件 （www.ebi.ac.uk/Tools/services）進行多序列比對分析。 蛋白表達及純化參考Li等的方法6進行PlclpP基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建、蛋白的誘導(dǎo)表達、組氨酸標簽（His-tag）親

8、和純化、SDS-PAG萼。 蛋白水解酶活性的檢測以B-酪蛋白為底物，在150 以L酶反應(yīng)液2.7以gB-casein,5以L0.1mol/LATP,2mmol/LZnCl2,50mmol/LTris-HCl（pH值為7.3）中加入50以L純化酶進行反應(yīng)。 將40C、pH值7.0條件下，30min內(nèi)水解B酪蛋白使D562nm值增加0.01的酶量定義為1個酶活性單位（U）7。參考Li等的方法6測定溫度、pH值，表明活性劑（SDSTween-20、Tween-80）和蛋白酶抑制劑 （phenylmethanesulfonylfluoride,PMSF）對PlClpP復(fù)合物酶活性的影響。2結(jié)果與分析

9、蛋白水解酶高活性菌株類芽胞桿菌CHN26的分離鑒 定 基于酶功能的篩選方法6,筆者所在實驗室從東海水產(chǎn) 養(yǎng)殖池塘底泥中分離獲得1株蛋白水解酶高活性菌株，經(jīng)16S rRNA基因序列測定(GenBank登錄號為KF460030)分析及 生理生化鑒定，發(fā)現(xiàn)其為厚壁菌門(Firmicutes)芽胞桿菌綱 (Bacilli)芽胞桿菌目(Bacillales)類芽胞桿菌科 (Paenibacillaceae)類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)的細菌，命名為類芽胞桿菌CHN266。筆者所在實驗室對該菌株的多種蛋白水解酶基因進行了研究，本次報道其中一種酪蛋白水解肽酶clpP基因的克隆和表達。 類芽胞桿

10、菌CHN26的PlclpP基因分子克隆及序列分析 迄今為止，國內(nèi)外涉及類芽胞桿菌中clpP基因功能的研究尚無文獻報道。 本研究利用目前GenBank數(shù)據(jù)庫中類芽胞桿菌屬Y412MC10菌株的全基因組信息(GenBank登錄號為NC_013406.1),基于其clpP基因序列設(shè)計了PCR擴增引物clpP-P1f/r。提取類芽胞桿菌CHN26基因組DNA并以其為模板進行PCR擴增， 獲得約0.6kb的單一PCR擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與克隆載體pGM-T連接， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞。篩選并提取Ampr陽性轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒，經(jīng)DNA序列測定發(fā)現(xiàn)，克隆所得類芽胞桿菌CHN26的clpP基

11、因全 長585bp,編碼194個氨基酸，預(yù)測分子量約為21ku,將 其命名為PlclpPo BLAST序歹吐匕對分析結(jié)果顯示，PlclpP序歹U與GenBank數(shù)據(jù)庫中類芽胞桿菌屬的ATP依賴型ClpP蛋白酶水解亞單 位氨基酸序列的相似性為71%98%,而與EcClpP的氨基酸 序列相似性僅為62%。 然而clpP基因多序列比對分析結(jié)果顯示，PlclpP基因序列含有S14_ClpP家族的特征性八肽結(jié)構(gòu)域 （KDIHMYIN,第59個至第66個氨基酸）（圖1）,其中第59個的賴氨酸（Lys58,K）、第60個的天冬氨酸（Asp59,D）、第64個的催化親核物質(zhì)（catalyticnucleoph

12、ile）酪氨酸（Tyr63,Y）為高度保守的催化三分體殘基（catalytictriadresidues）,在酪蛋白水解中發(fā)揮重要作用8。止匕外，PlclpP序列還含有 絲氨酸蛋白水解酶高度保守的催化活性位點 （Ser99-His124-Asp173）（圖1）。 PlclpP基因表達質(zhì)粒pET-28a-PlclpP的構(gòu)建與鑒定 基于本研究獲得的PlclpP基因序列,設(shè)計了攜帶限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和Hindm酶切位點的引物clpP-P2f/r,采用PCR方法擴增PlclpP基因，獲得單一PCR產(chǎn)物。采用BamHI和Hindin雙酶切PCR產(chǎn)物，回收純化酶切產(chǎn)物。 同時， 提取表達載體pET

13、-28a的質(zhì)粒DNA,經(jīng)BamHI和Hindin雙酶切為線性的DNA片段，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果見圖2。 將上述純化后的酶切片段經(jīng)T4-DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，在含有30以g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上，采用菌落PCR方法篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子 克隆（圖2）。提取陽性轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒DNA,經(jīng)BamHI和 HindID雙酶切驗證為單一DNA片段插入，大小約0.6kb（圖2）。經(jīng)DNA序列測定，驗證插入片段為PlclpP基因。 PlclpP基因的表達和純化 采用LB液體培養(yǎng)基（含30以g/mL卡那霉素）于20C培養(yǎng)含有重組表達質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（pET-2

14、8a-PlclpP）, 通過0.6mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達18h,獲得含有組氨酸標簽的重組PlClpP蛋白，分子量約為21ku,與預(yù)測的ClpP蛋白分子量大小相一致，SDS-PAG分析結(jié)果見圖3。利用Ni-NTA-His?Bindresin純化法純化大腸桿菌BL21菌體裂解后 的無細胞提取液，經(jīng)SDS-PAG分析洗脫液各組分，獲得了純化的目標蛋白PlClpP。在大力S桿菌BL21中異源表達的PlClpP蛋白在SDS-PAGES譜上呈現(xiàn)2個條帶，分子量分別約為21、25ku（圖3）。鑒于大腸桿菌EcClpP蛋白酶伴侶分子ClpA、ClpX的分子量分別為80、46ku9-10,推測PlClpP

15、可能與大腸桿菌BL21中未知伴侶分子形成復(fù)合物，未知伴侶分子的序列和功能有待進一步研究。采用BCA蛋白定量試劑 盒檢測PlClpP的表達量，結(jié)果顯示，1g細胞濕質(zhì)量可以產(chǎn)生純化的重組PlClpP蛋白復(fù)合物約0.54mg,約占細胞總蛋白的5.25%。 PlClpP復(fù)合物的蛋白水解酶活 本研究以非折疊態(tài)模式底物B-酪蛋白為底物，在含有 mmol/LATP的反應(yīng)液中分析純化PlClpP復(fù)合物在不同溫 度下的蛋白水解酶活性，PlClpP復(fù)合物的最適反應(yīng)溫度為 40C（圖4）,明顯高于類芽胞桿菌CHN26和大腸桿菌BL21的最適生長溫度37Co同時分析了該復(fù)合物在不同溫度下的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，PlClp

16、P復(fù)合物在1040c下處理3h 后相對酶活性仍高于90%,進一步證明了PlClpP復(fù)合物的嗜中溫反應(yīng)特性（圖4）。此外還分析了pH值對PlClpP復(fù)合物蛋白水解酶活性的影響，結(jié)果顯示，該復(fù)合物的最適反應(yīng)pH 值為7.0o在強酸（pH值 W6.0）、強堿（pH值A(chǔ)7.0）條件下于4C處理12h后，相對酶活性迅速減弱，而在pH值6.07.0條件下相對酶活性強于87%,證明PlClpP復(fù)合物的中性pH值反應(yīng)特性。 表面活性劑和蛋白酶抑制劑對PlClpP復(fù)合物酶活性 的影響 分別采用SDSTween-20、Tween-80表面活性劑于40C條件下處理純化的PlClpP復(fù)合物1h,并在最適溫度和pH值條

17、件下測定殘余酶活。結(jié)果顯示，終濃度為0.5%的表面活性 劑強烈抑制PlClpP性復(fù)合物的酶活性50%60%;PlClpP復(fù)合物對常規(guī)絲氨酸蛋白酶抑制劑具有較強的抗性，10mmol/L PMSF處理PlClpP復(fù)合物1h對其酶活性無明顯影響，表明PlClpP屬于一類非常規(guī)的絲氨酸蛋白酶。3結(jié)論 運用基因克隆技術(shù)，以分離鑒定獲得的蛋白水解酶高活 性類芽胞桿菌CHN26基因組DNA為模板，經(jīng)克隆鑒定該菌 株為一種新型蛋白水解酶基因PlclpP,編碼194個氨基酸， 分子量約為21ku。PlClpP氨基酸序列含有保守的ClpP家族 特征性八肽結(jié)構(gòu)域(KDIHMYIN,第59個至第66個氨基酸)，以 及

18、絲氨酸蛋白水解酶保守的催化活性位點 (Ser99-His124-Asp173)。采用大腸桿菌的pET表達系統(tǒng)構(gòu)建了PlclpP基因表達質(zhì)粒pET-28-PlclpP,在大腸桿菌BL21中實現(xiàn)了重組PlClpP蛋白的表達。利用組氨酸標簽(His-tag)親 和純化法獲得了PlClpP純化蛋白， 發(fā)現(xiàn)PlClpP可能與宿主菌未知伴侶分子形成蛋白復(fù)合物。PlClpP復(fù)合物具有ATP依賴 型酪蛋白水解酶活性，最適反應(yīng)溫度為40C、pH值7.0。 終濃度為0.5%的表面活性劑JSDSTween-20、Tween-80均強烈抑制PlClpP復(fù)合物的酶活性，而常規(guī)絲氨酸蛋白酶抑制劑 (PMSF)對其活性無抑

19、制作用。本研究填補了我國ClpP家 族蛋白水解酶研究領(lǐng)域的空白，為開發(fā)蛋白酶新基因資源、ClpP家族蛋白酶的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。 參考文獻： 1KrikO,BorchertTV,FuglsangCC.IndustrialenzymeapplicationsJ.CurrentOpinionBiotechnology,2002,13(4):345-435. 2KressW,MaglicaZ,Weber-BanE.Clpchaperoneeproteases:structureandfunctionJ.Researchin Microbiology,2009,160:618-628. 3S

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