T細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)異種特異性免疫耐受的作用探討

1、T細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)異種特異性免疫耐受的作用探討趙振林郭永章李立(昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院肝膽外科,昆明650031中國圖書分類號R39214文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號10002484X(20030620388204摘要目的:探討T細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)異種特異性免疫耐受的作用。方法:制備S D大鼠針對豚鼠的T細(xì)胞疫苗(T C V,然后用T細(xì)胞疫苗免疫正常S D大鼠,連續(xù)3周,每周1次,同時設(shè)空白對照組。以被免疫S D大鼠的脾細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞,以豚鼠的脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞(經(jīng)絲裂霉素處理,于接種前和每次接種后第5天進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(M LR,同時對外周血T細(xì)胞凋亡和C D4+、C D8+T細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測。結(jié)果

2、:M LR結(jié)果顯示,在T C V組,S D大鼠的脾細(xì)胞反應(yīng)程度比接種前顯著減弱(P<0101,接種后相同時點組間比較,T C V組顯著低于對照組(P<0101;接種T細(xì)胞疫苗后,外周血T細(xì)胞凋亡率比接種前顯著增加(P<0101,并隨著接種次數(shù)的增加而升高;隨著接種T細(xì)胞疫苗次數(shù)的增加,C D4C D8逐漸減小,與M LR 的cpm值的遞減趨勢一致。結(jié)論:T細(xì)胞疫苗成功地誘導(dǎo)出異種特異性免疫耐受。T細(xì)胞疫苗可能通過誘導(dǎo)抗原特異性的反應(yīng)性T細(xì)胞凋亡去除獨特型T細(xì)胞克隆,進(jìn)而誘導(dǎo)出抗原特異性免疫耐受;C D4C D8與免疫耐受的產(chǎn)生有關(guān),C D4C D8降低有利于特異性免疫耐受的形

3、成。關(guān)鍵詞T細(xì)胞疫苗;免疫耐受;異種An experimental study of T cell vaccination in inducing heterologous antigen2specific immune toleranceZH AO Zhen2Lin,G UO Yong2Zhang,LI Li1Department o f Hepato2Biliary Surgery,the Second Affiliated Hospital,Kun2 ming Medical College,Kunming650031,ChinaAbstractObjective:T o investi

4、gate the effect and the mechanism of T cell vaccination in inducing heterolog ous antigen2specific im2 mune tolerance1Methods:T cell vaccination were made from the spleen cells of S D rats,which were induced by C onA and were challenged with the spleen cells of guinea2pig(the heterolog ous specific

5、antigen1N ormal S D rats were vaccinated intraperitoneally with T C V or1640cul2 ture bu ffer(blank controlrespectively1One2way mixed lymphocyte reaction(M LR、the apoptosis of peripheral T cells and the rate of C D4C D8 in peripheral blood were assayed before and after vaccination.R esults:M LR show

6、ed that the response captivity of S D rat spleen cells in T C V group were suppressed significantly after vaccination(P<0101;T he percentage of peripheral T cell apoptosis was increased significantly after vaccination in T C V group;T he rate of C D4C D8of peripheral blood was significantly decre

7、ased after vaccination in T C V group1Conclusion:X e2 no2Ag specific immune tolerance can be success fully induced by T cell vaccination;It may be critical for the T cell vaccination to induce the apop2 tosis of antigen2specific reactive T cell in inducing xen o2Ag specific immune tolerance;C D4C D8

8、is closely related to the forming of immune toler2 ance,the proliferation of C D8+antiidioty pic T cell may play an im portant role in inhabiting the response capability of idioty pic T cell1 K ey w ordsT cell vaccination(T C V;Immune tolerance;Heterolog ous隨著器官移植技術(shù)的快速發(fā)展和移植成功率的顯著提高,等待器官移植的人數(shù)迅速增加,供體器

9、官短缺問題日趨突出,尋求異種供源已成為開發(fā)新的器官供源的重要途徑,而利用異種供體要解決的首要問題就是免疫排斥,應(yīng)用常規(guī)的免疫抑制劑不能抑制異種免疫排斥反應(yīng)1,所以如何誘導(dǎo)異種特異工作單位:山西醫(yī)大第二醫(yī)院,太原030000作者簡介:趙振林(1967年-,男,博士研究生,副教授,主要從事移植免疫研究,Email:趙zh16245;郭永章(1940年-,男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事肝膽外科基礎(chǔ)及臨床研究;李立(1962年-,男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事肝移植研究。性免疫耐受就成為移植免疫研究的重要課題。特異性免疫耐受的形成是一個多環(huán)節(jié)多步驟的過程,已經(jīng)有大量研究從不同角度用不同方法誘導(dǎo)免疫耐受

10、,如新生動物免疫耐受法,全身照射加供體抗原輸注法,應(yīng)用單克隆抗體等。T細(xì)胞疫苗是由異種抗原活化的特異性反應(yīng)性T細(xì)胞經(jīng)化學(xué)或物理的方法滅活制備而成2。早期研究表明,自身反應(yīng)性T細(xì)胞疫苗可以抑制實驗性自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展,應(yīng)用T細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)移植免疫耐受是目前新的研究領(lǐng)域。已有研究表明,T細(xì)胞疫苗可以延長同種移植物的存活時間3,但關(guān)于T細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)異種免疫耐受的報道甚少,本研究將制備異種抗原特異性T細(xì)胞疫苗,接種給受體大鼠,于不同時點進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),以觀察特異性免疫耐受的建立情況,同時對外周血T細(xì)胞凋亡疫苗及T細(xì)胞亞群C D4、C D8通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,進(jìn)一步探討T 細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐

11、受的機(jī)理。1材料與方法111動物S D大鼠為雄性,重量250300g;豚鼠69個月齡,雄性。以上動物均由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。112試劑M ouse antiRat C D8RPE(Serotec Ltd; M ouse antiRat C D4FITC(Serotic Ltd;Annexin V2FITC (BD1Biosciences;3H2T DR(北京原子能研究所;C onA(Sigma;RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(LIFE TECH N2 O LOGIES;淋巴細(xì)胞分離液(上海恒信化學(xué)試劑有限公司;絲裂霉素(ky owa hakko C o Ltd;胎牛血清(北京元亨圣馬生物

12、技術(shù)研究所。113實驗分組實驗分為兩組,實驗組:供體特異性TC V免疫組,用TC V免疫S D大鼠(1×108ml-1 012ml次i.p。第2組:對照組用RPMI1640培養(yǎng)液替代TC V。114T細(xì)胞疫苗的制備及免疫動物無菌條件下將豚鼠的脾臟取下,剪碎制成勻漿,Hanks液稀釋, 200目不銹鋼網(wǎng)過濾,分別制成細(xì)胞懸液,輕輕加入到淋巴細(xì)胞分離液的上層離心(1500rmin,20分鐘,然后吸取中層細(xì)胞,用Hanks液清洗2次,最后用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108ml-1。臺盼藍(lán)拒染法鑒定活細(xì)胞數(shù)>95%。取制備好的豚鼠脾細(xì)胞懸液,免疫S D大鼠(腹腔

13、注射,每只1×108 ml-1,于以后2周用同樣方法加強(qiáng)2次,于第3次免疫后的第5天,取出被免疫的S D大鼠的脾臟制備不含紅細(xì)胞的脾細(xì)胞懸液,用完全培養(yǎng)液(每100ml 含RPMI1640液85ml,滅活胎牛血清10ml、谷氨酰胺2mm ol、丙酮酸鈉1mm ol、青霉素、鏈霉素各1×10u,用7%的NaC O3調(diào)pH至712調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105ml-1,加C onA215gml,混合后移至100ml 的培養(yǎng)瓶內(nèi)(10ml瓶,置5%C O237孵箱中培養(yǎng)48小時后收集細(xì)胞,然后加入絲裂霉素C(25gml處理細(xì)胞(37水浴45分鐘,用pH為712的P BS 洗滌

14、3次后,用1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度到1×108 ml-1,制成T淋巴細(xì)胞疫苗備用。以每只012ml經(jīng)腹腔注射給正常的S D大鼠,每周接種1次,共3次。115單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(M LR(3H2T DR摻入法在TC V接種前和每次接種后第5天分別進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(M LR,反應(yīng)細(xì)胞為經(jīng)TC V 免疫后的S D大鼠的脾細(xì)胞,刺激細(xì)胞為豚鼠的脾細(xì)胞(用絲裂霉素處理,兩者濃度均為1×106 ml-1,取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入反應(yīng)細(xì)胞100l,刺激細(xì)胞100l,對照組不加刺激細(xì)胞,用1640培養(yǎng)液代替,每份標(biāo)本設(shè)3復(fù)孔,在含體積分?jǐn)?shù)為5%C O237飽和濕度下培養(yǎng)96

15、小時,終止培養(yǎng)前18小時每孔加入1Ci3H2T DR。培養(yǎng)結(jié)束后,用HY S24多頭細(xì)胞收集器(海軍醫(yī)學(xué)研究所收集混合反應(yīng)細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上,用蒸餾水反復(fù)沖洗,將樣品濾紙置于6080的烤箱內(nèi)烘干,將紙片分別置于閃爍瓶中,每瓶加閃爍液5ml,用S N26904液體閃爍計數(shù)器(上海核福光電儀器有限公司測定每分鐘脈沖數(shù)值(cpm值。116外周T細(xì)胞凋亡的檢測分別于規(guī)定時點取被免疫S D大鼠的外周靜脈血,置于淋巴細(xì)胞分離液上離心(1500rmin,20分鐘,取中層細(xì)胞,用P BS液清洗2次,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1,每管取100l細(xì)胞,加AnnexinV2FITC5l和PI5l,常

16、溫避光孵育15分鐘后,加400l結(jié)合液,用FACS2 Calibur流式細(xì)胞儀(美國Becion Dickins on分析。117外周T細(xì)胞亞群的檢測分別于規(guī)定時點取被免疫S D大鼠的外周靜脈血,置于淋巴細(xì)胞分離液上離心(1500rmin,20分鐘,取中層細(xì)胞,用P BS 液清洗2次,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1,每管取100l細(xì)胞,分別加PE標(biāo)記的抗大鼠C D8單抗和FITC標(biāo)記的抗大鼠C D4單抗各10l,常溫避光孵育20分鐘后,P BS液清洗2次,調(diào)整細(xì)胞濃度后,用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國Becion Dickins on分析。118統(tǒng)計學(xué)處理以P<01

17、05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn),兩組組間參數(shù)比較用t檢驗,組內(nèi)各參數(shù)比較用方差分析,定量資料用x±s表示。2結(jié)果211單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(M LR在實驗組, cpm平均值接種后顯著低于接種前(P<0101,接種后兩組間相同時點比較實驗組顯著低于對照組(P<0101,在對照組,接種前后比較無顯著差異(見表1。212外周血T細(xì)胞凋亡的檢測用Annexin V2FITC 通過流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞的早期凋亡,在對照組,檢測各時點T細(xì)胞凋亡百分率無顯著差異;而在實驗組,TC V接種后,T細(xì)胞凋亡百分率顯著增加(見圖1。213外周血T細(xì)胞亞群C D4、C D8及其比值C D4C D8的檢測C

18、 D4+和C D8+T細(xì)胞各自所占的百分比在各組均未表現(xiàn)出明顯的趨勢性;而對于C D4在對照組各時點無顯著差異(見圖2。C D8,在實驗組接種后比接種前表現(xiàn)出顯著的減小,表1TCV接種前后單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(ML Rcpm值組間和組內(nèi)比較(x±sT ab.1Comp arison of the results of ML R(cpmbetw een experimental group and control group(x±sPre2inoculation The5th day after the1st inoculation The5th day after the2

19、nd inoculation The5th day after the3rd inoculation Experimental group33004±152512119±982247500±1091242754±74124C ontrol group32178±580831094±45211332432±23351330818±219013N ote:vs pre2inoculation,1P<0105,2P<0101;vs control group,3P<0105,4P<0101. 圖1

20、實驗組TCV接種前后外周血T細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.1F low cytometric analysis of the apoptosis of peripheral T cells in experimental group 圖2實驗組TCV接種前后外周血T細(xì)胞亞群CD4、CD8流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.2F low cytometric analysis of CD4and CD8of peripheral T cell subsets3討論本實驗的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果發(fā)現(xiàn),接種T 細(xì)胞疫苗5天后的S D大鼠脾細(xì)胞對刺激細(xì)胞的應(yīng)答能力顯著降低,而且隨著接種次數(shù)的增加其反應(yīng)能力進(jìn)一

21、步降低,而對照組反應(yīng)細(xì)胞的應(yīng)答能力在接種后各時點均顯著高于實驗組。由此表明,應(yīng)用T細(xì)胞疫苗可以誘導(dǎo)異種抗原特異性免疫耐受。免疫耐受的誘導(dǎo)是一個有多環(huán)節(jié)參與的復(fù)雜過程,T 細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)理目前尚不清楚,可能與下列幾方面有關(guān):T細(xì)胞疫苗是由特異性抗原活化的T細(xì)胞經(jīng)用物理或化學(xué)方法滅活后制成的,是滅活的自身反應(yīng)性T細(xì)胞。它本身表達(dá)一組特定的T細(xì)胞受體(TCR,誘導(dǎo)產(chǎn)生針對TCR的抗體,導(dǎo)致針對特定抗原的特異無反應(yīng)性,此作用具有抗原特異性4;TC V可以誘導(dǎo)作用于活化T細(xì)胞的T 抑制細(xì)胞或者殺傷細(xì)胞2抗獨特型T細(xì)胞的種植,以抑制抗原反應(yīng)性T細(xì)胞或去除抗原反應(yīng)性T細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),T細(xì)胞疫苗可以

22、誘導(dǎo)并激活抗獨特型T 細(xì)胞,抗獨特型T細(xì)胞是指活化T細(xì)胞的T抑制細(xì)胞或者殺傷細(xì)胞,其效應(yīng)具有抗原特異性,上調(diào)的抗獨特型T細(xì)胞可以抑制獨特型T細(xì)胞的功能,從而抑制免疫應(yīng)答5;T細(xì)胞疫苗不僅表達(dá)它本身一組特定的TCR,同時也表達(dá)了與活化T細(xì)胞相同的活化分子,如I L22R粘附分子等,以活化T細(xì)胞作為抗原進(jìn)行免疫,誘導(dǎo)產(chǎn)生針對T細(xì)胞表面活化分子的抗體,如抗I L22R抗體,抗C D4、C D8等粘附分子的抗體,此作用不具有抗原特異性6。本研究結(jié)果表明,應(yīng)用了T細(xì)胞疫苗以后,發(fā)生了顯著的外周血T細(xì)胞凋亡,由此提示T細(xì)胞疫苗可能通過誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡去除抗原反應(yīng)性T細(xì)胞而誘導(dǎo)特異性免疫耐受。T細(xì)胞疫苗如何誘

23、導(dǎo)抗原反應(yīng)性T細(xì)胞凋亡尚不清楚,抗獨特型T細(xì)胞和抗獨特型抗體可能通過與獨特型T細(xì)胞的接觸或結(jié)合進(jìn)行信息傳遞,從而啟動獨特型T細(xì)胞的凋亡程序,誘導(dǎo)了獨特型T細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),在實驗組第1次接種TC V后, C D4C D8明顯降低,隨著接種TC V次數(shù)的增加, C D4C D8進(jìn)一步減小,與M LR的cpm值的遞減趨勢一致。有研究表明,可以通過轉(zhuǎn)移耐受動物T細(xì)胞的C D4和C D8亞型而誘導(dǎo)免疫耐受,C D8+抑制性T 細(xì)胞在免疫耐受方面起著重要的作用7。它可以抑制獨特型T細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)。4參考文獻(xiàn)1Auchinclose H J R,Sachs D H.X enogeneic tra

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