骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及其應(yīng)用的研究進(jìn)展(一)

1、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及其應(yīng)用的研究進(jìn)展(一)    【摘 要】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，又稱骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，是骨髓中非造血實質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞，具有高度的自我復(fù)制能力和多向分化潛能，可分化成多種細(xì)胞。 【關(guān)鍵詞】 骨髓 干細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，又稱骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，是骨髓中非造血實質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞，具有高度的自我復(fù)制能力和多向分化潛能，可分化成多種細(xì)胞。近來研究表明它可以向三個胚層的多種組織分化，如來源于外胚層的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等，MSCs移植為腦缺血患

2、者開辟了一種新的治療方法。本文對MSCs移植治療腦缺血的研究綜述。 1 骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特性 1.1 目前發(fā)現(xiàn)至少存在3種形態(tài)的MSCs。Colter等從培養(yǎng)的人骨髓細(xì)胞中分離出MSCs后，發(fā)現(xiàn)來自單細(xì)胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平MSCs外，還有一種非常小的圓形細(xì)胞，這種小圓形細(xì)胞有更強(qiáng)的折光性，它們比大的MSCs能更快分裂、增殖，并且有更強(qiáng)的多向分化潛能，當(dāng)將MSCs放在不同的微環(huán)境內(nèi)時，它們可相應(yīng)地分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或成肌細(xì)胞等1-3。MSCs具有多向分化的潛能，MSCs經(jīng)靜脈途徑或局部注射移植到不同的組織時，MSCs即可在相應(yīng)的組織內(nèi)分化形成該類組織細(xì)胞3，4

3、。 1.2 MSCs的易粘附、易貼壁生長，易增殖特性使得它們經(jīng)過數(shù)次換液和傳代后得到分離、純化3。 2 骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞 最近研究發(fā)現(xiàn)，在特定的實驗條件下可將人、大鼠及小鼠等的MSCs在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣和膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，Sanchoz Ramos等發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)或腦源性營養(yǎng)因子(brain-derived neuotrofic factor，BDNF)可誘導(dǎo)人及小鼠的少數(shù)MSCs分化為神經(jīng)元樣及膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，它們表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)志物巢素蛋白(nestin)及其RNA、神經(jīng)元標(biāo)記物神經(jīng)元特異性核

4、蛋白(neuron specific nuclear protein，NeuN)、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。將人或小鼠的MSCs與胚胎大鼠中腦或紋狀體神經(jīng)元共培養(yǎng)時，部分MSCs分化為NeuN陽性的神經(jīng)元樣細(xì)胞及GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，因此，除了可能通過營養(yǎng)因子和細(xì)胞因子傳遞信號外，細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸還可能在MSCs的分化中發(fā)揮重要作用5。 3 MSCS移植治療局灶性腦缺血的可行性及原理 3.1 供體與受體 MSCs移植治療腦缺血多為同種異體移植，如Brazelton等6采用的供體鼠為成熟轉(zhuǎn)基因

5、大鼠，鼠齡810w，受體鼠為致死量放療后的相同鼠齡的大鼠，移植的為新鮮未經(jīng)培養(yǎng)的MSCs。有些學(xué)者將供體鼠化療(5-氟尿嘧啶，150mg/kg，腹部注射) 2d后取其骨髓進(jìn)行體外培養(yǎng)3代，移植前72h加BrdU進(jìn)行標(biāo)記，受體鼠亦為相同鼠齡相同體重的同種鼠7。Zhao等8的研究中，hMSCs來自于1035歲的健康志愿者，hMSCs轉(zhuǎn)染了增強(qiáng)的綠色熒光蛋白基因，經(jīng)26代培養(yǎng)后移植入成熟雄鼠體重(230250g)，結(jié)果未出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，說明MSCs具有相當(dāng)大的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)能力。上述研究中，或是供體經(jīng)化療或是受體經(jīng)放療或是MSCs經(jīng)多次傳代培養(yǎng)以降低免疫活性，從而減少移植物抗宿主反應(yīng)的發(fā)生。 3.2

6、 MSCs在腦內(nèi)有遷移能力 Kopen等將小鼠MSCs注入新生小鼠側(cè)腦室后12d，發(fā)現(xiàn)MSCs已遷移至前腦、小腦，而且不破壞腦組織結(jié)構(gòu)，其遷移方式與出生后早期的神經(jīng)發(fā)育過程相同，提示MSCs的行為類似神經(jīng)前體細(xì)胞9。 3.3 目前MSCs移植治療局灶性腦缺血的途徑有3種：腦立體定向移植，經(jīng)頸內(nèi)動脈注射移植及經(jīng)靜脈注射移植 腦立體定向移植：根據(jù)缺血損傷的部位采用腦立體定向術(shù)，將一定體積適當(dāng)數(shù)量的MSCs直接注射到缺血損傷部位。該方法的缺點是：(1)對腦組織產(chǎn)生一定程度的損傷；(2)移植物的數(shù)量受一定程度的限制；(3)不便多次多靶點注射10。頸內(nèi)動脈注射移植：可將MSCs直接經(jīng)缺血側(cè)頸內(nèi)動脈注入，

7、該方法與立體定向法相比有以下優(yōu)點：(1)移植的MSCs可廣泛分布于缺血半暗帶區(qū)；(2)創(chuàng)傷較小；(3)可允許較多數(shù)量、較大體積的移植物輸入；(4)有更多的BrdU陽性細(xì)胞在缺血區(qū)存活，缺點是：需要一定的技術(shù)條件，經(jīng)靜脈注射移植簡便、安全、快捷、有效，一次可輸入較多數(shù)量的MSCs，而且進(jìn)入腦內(nèi)的MSCs分布在缺血壞死灶及其周邊區(qū)較大的范圍內(nèi)。經(jīng)靜脈或動脈注射較腦局部注射優(yōu)越，因MSCs隨血液循環(huán)分布更廣，除大部分集聚于靶點梗死區(qū)周邊的半暗帶區(qū)外，對側(cè)鏡區(qū)也有少量分布。移植后MSCs存活和分化需要各種細(xì)胞因子的營養(yǎng)、微環(huán)境的平衡及一定的血液供應(yīng)，因此，最適合注射部位應(yīng)在梗死區(qū)周邊的半暗帶區(qū)。 3.

8、4 移植的時間 動物研究從腦梗死模型建立后1天到1月移植均有，有關(guān)不同移植時間對神經(jīng)的增生、細(xì)胞分化、整合及神經(jīng)功能恢復(fù)的影響的研究還較少。急性期時興奮毒性神經(jīng)基質(zhì)、自由基等的釋放對新生組織造成損害?？紤]到腦梗死的自然恢復(fù)過程，有些學(xué)者在腦梗死后數(shù)月進(jìn)行移植，疤痕組織的形成可能會影響移植物的生長。 3.5 MSCs可參與正常的基質(zhì)代謝，修復(fù)細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的增殖、分化和遷移，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)。 由于嚴(yán)重缺血或細(xì)胞因子的刺激，基質(zhì)祖細(xì)胞可以沿內(nèi)皮祖細(xì)胞伸展并聚集，因而有助于血管新生和(或)損傷愈合，Chen等發(fā)現(xiàn)，MSCs移植后14d，BrdU標(biāo)記的MSCs可能與內(nèi)皮祖細(xì)胞一

9、樣發(fā)揮作用，促進(jìn)缺血組織的血管再生和損傷神經(jīng)組織的修復(fù)。 3.6 移植的細(xì)胞數(shù) 既往研究腦局部注射移植的細(xì)胞總數(shù)為2.25×105(分為3個點注射)，靜脈或動脈注射移植的細(xì)胞數(shù)為26×106時，神經(jīng)功能缺失癥狀均有恢復(fù)8，而靜脈移植的細(xì)胞數(shù)為1×106時，神經(jīng)功能恢復(fù)不明顯。MSCs濃度太低，達(dá)不到治療效果，濃度太高易致靜脈栓塞。 3.7 移植后的表達(dá)率 對供體來源的MSCs用BrdU標(biāo)記，雙染后免疫熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下計算BrdU和NeuN或GFAP均為陽性的細(xì)胞以判斷移植后的表達(dá)情況。表達(dá)率與移植的方式有關(guān)5，有報道一些神經(jīng)營養(yǎng)因子可以提高誘導(dǎo)分化后的表

10、達(dá)率，在腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)及堿性纖維母細(xì)胞生長因子(bFGF)存在的情況下，NeuN的表達(dá)率達(dá)到2%，GFAP達(dá)8%。 3.8 MSCs治療腦梗塞 研究表明部分MSCs可通過正常的血腦屏障遷移到腦內(nèi)廣泛的區(qū)域，局灶性腦缺血時，由于血腦屏障的破壞，可能有助于MSCs選擇性遷入缺血腦區(qū)，此外，缺血腦組織的炎癥等缺血相關(guān)信號也可能誘導(dǎo)和促進(jìn)MSCs的遷移，由于腦缺血后局部微血管表達(dá)的粘附因子的引導(dǎo)，經(jīng)靜脈或頸內(nèi)動脈輸入體內(nèi)的MSCs可以分化為類似神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞，這些細(xì)胞主要分布在缺血區(qū)，顯然腦內(nèi)的特有微環(huán)境，尤其是缺血損傷信號誘導(dǎo)了MSCs

11、的遷移、分化，缺血微環(huán)境似乎有利于MSCs的存活、增殖，腦缺血可以誘導(dǎo)腦內(nèi)尤其是缺血周邊區(qū)內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcellline derived neurotrophic factor，GDNF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子1(transforming growth factor 1，TGF1)等神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，MCAO后，BrdU陽性的MSCs高度集中在缺血周邊區(qū)，該區(qū)表達(dá)的神經(jīng)營養(yǎng)因子可能對隨后移植的MSCs的存活、分化或

12、遷移有重要作用10。 4 展望 MSCs的移植，尤其是自體MSCs移植克服了諸如倫理免疫排斥等問題，因此有更好的應(yīng)用前景，MSCs極易在腦內(nèi)存活、分化及整合，移植后并不產(chǎn)生炎癥和免疫排斥反應(yīng)，所以MSCs移植治療局灶性腦缺血是切實可行的，但是下列問題需要進(jìn)一步解決：(1)經(jīng)靜脈或頸動脈注射的MSCs遷移入腦內(nèi)的機(jī)制，以提高M(jìn)SCs進(jìn)入腦內(nèi)的數(shù)量；(2)MSCs在腦內(nèi)遷移、分化和存活的機(jī)制及影響因素；(3)MSCs在腦內(nèi)分化的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞能否取代已死亡的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，分化的神經(jīng)元能否與宿主神經(jīng)元形成功能性突觸聯(lián)系和神經(jīng)環(huán)路，它們在腦缺血損傷恢復(fù)中的地位；(4)MSCs在腦內(nèi)可否產(chǎn)生有關(guān)神

13、經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)并參與神經(jīng)功能重建；(5)將攜帶有關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子或細(xì)胞因子基因的載體轉(zhuǎn)染MSCs，使其在缺血腦內(nèi)表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子等，從而達(dá)到治療局灶性腦缺血的目的；(6)高效誘導(dǎo)MSCs體外分化的最佳方法及分化的神經(jīng)元的移植對局灶性腦缺血的作用；(7)MSCs和基因治療 骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植入腦幾天內(nèi)發(fā)生凋亡，那么如何提高其存活率將成為一個主要問題。Bcl-2基因是細(xì)胞凋亡的重要抑制基因，近年發(fā)現(xiàn)它在腦缺血中表達(dá)并在其中起重要作用，Shimizu等研究發(fā)現(xiàn)，缺血誘發(fā)的bcl-2蛋白可增強(qiáng)腦對后繼缺血的耐受性，具有神經(jīng)保護(hù)作用，減少缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此可嘗試?yán)肂cl-2基因抗骨髓

14、基質(zhì)細(xì)胞凋亡觀察是否增強(qiáng)MSCs治療腦梗死的效果。 參考文獻(xiàn) 1 Woodbury Dl. Adult rat and human bone Marrow stromal cells differentiate into Neurons. Neuro sci Res，2000，61：364-370 2 Colter DC. Identification of asub population of rapidly self renewing adult potential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Pr

15、oc Natl Acad Sci U S A，2001，98：7841-7845 3 Prockop DJ. Marrow stromal cells for nonhematoietic tissues. science，1997，276：71-74 4 Gao J，Dennis JE，Muzic RF，et al. The dynamic invivo distribution of bone marrow derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs，2001，169：12-20 5 Sanchez

16、 Ramos J，Song S，Cardozo Pelaez F，et al. Adult bone marrow stromal cells diffrentiate into neural cells invitro. Exp Neurol，2000，164：247-256 6 Brazelton TR，Rossi FMV，Keshet GI，et al. From marrow to brain：expression of neuronal phynotapes in adult mice【J】.science，2000，290：1775-1779 7 LiY，Chen J，Wang L

17、，et al. Treatment of stroke in rat with Intracarotid administration of marrow stromal cells【J】.Neurology，2001，56：1666-1672 8 zhao LR，Duan WM，Reyes M，et al. Human bone marrow stem cells exhibit neural phenotypes and ameliorate neurological deficits after grafting into the ischemic brain of rats【J】.Exp Neurol，2002，74(1)：11-20 9 Wang L，Li Y，Lu D，et al. Neuro strophins promote bone marrow stromal cells(MSCs)