時間分辨技術(shù)的原理

1、時 間 分 辨 技 術(shù) 的 原 理目前最先進(jìn)的免疫檢測技術(shù)：1、時間分辨原理：用三價稀土離子及其鰲合劑作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素或酶，標(biāo) 記蛋白質(zhì)、多胎、激素、抗體、核酸探針或生物流行性細(xì)胞，當(dāng)反應(yīng)體系發(fā)生 后，用時間分辨儀器測定最后產(chǎn)物中熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度或相對熒光強(qiáng)度 比值，來判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析之目的。2、時間分辨原子標(biāo)記物的特點(diǎn)：發(fā)射光和激發(fā)光有較大的 STOKES-移一一高特異性長壽命熒光，降低其他物質(zhì)的熒光干擾一一高靈敏度 半衰期長達(dá)幾十萬年，試劑受干擾小一一高穩(wěn)定性原子標(biāo)記與大分子標(biāo)記物的對比原子標(biāo)記物大分子標(biāo)記物標(biāo)記位點(diǎn)多個，可達(dá)20個只有1個對被

2、標(biāo)記物蛋白活性的影響影響小，基本無影響影響大，經(jīng)常影響蛋白活性對被標(biāo)記物空間結(jié)構(gòu)的影響無影響，保證穩(wěn)定性影響大，造成試劑的不穩(wěn)定受環(huán)境因素的影響影響小影響大，溫度影響3、波長分辨：標(biāo)記離子的熒光激發(fā)光波長范圍較寬， 發(fā)射光光譜范圍較窄，是類線光譜, 有利于降低本底熒光強(qiáng)度，提高分辨率。激發(fā)與發(fā)射光之間有一個較大的 STOKE腦移，有利于排除非特異熒光的 干擾，增強(qiáng)測量的特異性。4、時間分辨:標(biāo)記離子螯合物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度高，壽命長，有利于消除樣品及環(huán)境中熒 光物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。每一秒名檢測樣品1000次，取其中不受干擾的400次的均值作為測定值, 有利于提高檢測的準(zhǔn)確性。時間分辨技術(shù)取代酶免

3、、放免是免疫檢測技術(shù)發(fā)展的必然趨勢！RIA （放免）放射性（125I）,對環(huán)境和身體的危害，已經(jīng)為重視環(huán)保的國家逐步取消，如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗(yàn)室。125I半衰期短，導(dǎo)致試劑的有效期短，需每次定標(biāo)，造成很大的浪費(fèi)。由于標(biāo)記物（125I）的不斷變化，帶來藥盒批間、批內(nèi)較大的變異，標(biāo)準(zhǔn) 曲線無法保存?zhèn)溆谩LESA（酶免）靈敏度、重復(fù)性不及放免，易造成漏檢和假陽性。酶的純度和反應(yīng)過程容易受環(huán)境因素影響，導(dǎo)致穩(wěn)定性、重復(fù)性不好。與其它技術(shù)的相對優(yōu)勢：（1）、是現(xiàn)有的免疫檢測方法中靈敏度最高的（2）、是現(xiàn)有的免疫檢測方法中穩(wěn)定性最好的（3）、多標(biāo)記檢測是目前所有免疫檢測技術(shù)中獨(dú)一無二的TRF技術(shù)

4、與電化學(xué)發(fā)光的比較時間分辨安光電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物四種原子：Eu,Sm,Te,Dy一種原子:釘多標(biāo)記技術(shù)有無科研項(xiàng)目能（1000多種科研項(xiàng)目）無試齊I種類58種臨床,24種科研，共82種40種臨床，無科研試劑價格低高TRF與化學(xué)發(fā)光的比較時間分辨安光化學(xué)發(fā)光發(fā)光效率95%1%重復(fù)檢測口尢數(shù)次重復(fù)/、口重復(fù)本底噪聲零本底干擾大靈敏級數(shù)10-1910-15標(biāo)記物原子大分子化合物標(biāo)記位點(diǎn)每個抗體可達(dá)20個1個標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定達(dá)一年以上穩(wěn)定2到4周多標(biāo)記有,最多口達(dá)四標(biāo)記無科研開發(fā)有無時間分辨熒光免疫定量分析簡介時間分辨熒光分析（Timeresolved Fluoroimmunoassay,TRFIA是一種非

5、同位素免 疫分析技術(shù)，它用鐲系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鐲系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時間分 辨技術(shù)測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進(jìn)行信號分辨，可有效地排除非異熒光的 干擾，極大地提高了分析靈敏度。解離增強(qiáng)鐲元素?zé)晒饷庖叻治鍪菚r間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基 團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，使其一端與錯（Eu）連接，另一端與抗體抗原分子上的自由氨基連接， 形成EU標(biāo)記的抗的抗原，經(jīng)過免疫反應(yīng)之后生成免疫復(fù)合物。由于這種復(fù)合物在水中的 熒光強(qiáng)度非常弱，因此加入一種增強(qiáng)劑，使u3+A復(fù)合物上解離下來，自作u3同增強(qiáng)劑 中的另一種螯合劑螯形成一種膠態(tài)分子團(tuán)，這種分子團(tuán)在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強(qiáng)的熒

6、光，信號增強(qiáng)了百萬倍。因?yàn)檫@種分析方法使用了解離增強(qiáng)步驟，因此稱為解離增強(qiáng)鐲系 元素?zé)晒饷庖叻治?。乙肝病毒（HBV標(biāo)記物的檢測方法常用測定乙肝病毒的抗原、抗體標(biāo)記物，由。年代末70年代初的瓊脂擴(kuò)撒法，依次發(fā)展為血凝法一酶聯(lián)免疫吸BtELISA、同位素免疫標(biāo) 記（RIA）一化學(xué)發(fā)光免疫分析、生物發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光免疫標(biāo)記和0年代中建立的稀土 離子熒光標(biāo)記（時間分辨熒光免疫分析）等不同的檢測方法。隨著科學(xué)的發(fā)展和檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，其方法每發(fā)展一步，乙肝標(biāo)記物檢出的靈敏度和準(zhǔn)確性都得到不同的提高。時間分辨熒光免疫分析（TRF） 為近年新研制成功的用三價稀土離子作為示蹤物，以單克隆抗體包被支持物與樣品中抗

7、原反應(yīng)，再加入有銪（ EU） 標(biāo)記的抗體，進(jìn)行反應(yīng)檢測，可大大降低一般同位素和熒光標(biāo)記受環(huán)境干擾缺點(diǎn)，提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)性，該TRF法檢測乙肝病毒標(biāo)記物較其他方法靈敏度高特異性好，干擾因素少,TRF%目前檢測乙肝 病毒標(biāo)記物最理想的方法。TR碇量檢測乙肝病毒“兩對半”為臨床診斷乙肝提供了新手段，有助于臨床客觀的分 析HBVe染情況、療效的觀察和轉(zhuǎn)歸等情況的分析，至少可對下列情況更具有獨(dú)特的診斷 價值： 1、治療前進(jìn)行病毒定量檢測，可以指導(dǎo)選擇抗病毒藥物，避免盲目用藥。2、治療后定量間接判斷體內(nèi)病毒數(shù)量，有助于療效的觀察。3 、懷孕前進(jìn)行定量測定，有助于選擇有利于的懷孕時機(jī)。乙肝孕婦進(jìn)行定量

8、檢查，有助于使部分病人得到及時的正確的診斷目前我科已正式開展了乙肝二對半標(biāo)RFIA定量分析，其每一項(xiàng)的正常值范圍均是由我 國衛(wèi)生部根據(jù)美國雅培的標(biāo)準(zhǔn)而制定，其靈敏度，準(zhǔn)確度，及精確度都有遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于一般的ELISA法，乙肝兩對半的定量制定將給臨床提供一個關(guān)于乙肝診斷及療效，預(yù)后判斷的更可 靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1、 極大地提高了檢測的靈敏度時間分辨熒光免疫定量技術(shù)（TRFIA中測HbsA艮 敏度可達(dá)0.2ng/ml,而酶標(biāo)（EIASA檢測的靈敏度是2ng/ml,極大地提高檢測的靈敏度。 因此，在急性乙肝早期能及早檢HHbsAg確證HBV染，縮短窗口期；其次，可發(fā)現(xiàn)低 濃度HbsAg1帶者；在部分慢性乙肝患

9、者中，由于機(jī)體缺乏釉B也蟆蛋白的免疫應(yīng)答， HbsA辰達(dá)較低，酶標(biāo)檢測可出喇bsA鼻HbsAb勻陰性的情況，TR豉術(shù)則可避免這些 情況的發(fā)生，為正確判斷病情提供依據(jù)。2、 能動態(tài)觀察療效和監(jiān)測病情1) 定量分析HBsAg口 HBsAb勺濃度變化，可預(yù)見急性乙肝是否處于恢復(fù)期。如HBsA際度降低，HBsAK度逐漸升高，可說明病，懵正往恢復(fù)期發(fā)展；反之HBsA際度 處于較高水平或上升趨勢，而HBsAb-直處于較低水平，則易發(fā)展為慢性乙肝或病毒攜帶 者。2) 定量分析HBeA和HBeAb勺濃度變化，可反映病情變化和治療效果。定量測定能明確檢測HBeA和HBeAb專換的時期，即表現(xiàn)為HBeA軟度下降和

10、HBeAb高的過 程。高濃度的HBeA還可間接提示病毒處于高復(fù)制狀態(tài)具有較高傳染性。高濃度的HBeAb 一方面提示病情好轉(zhuǎn)而在某些時候(如肝功能指標(biāo)很差)則可能與肝壞死、肝硬化、肝癌 有關(guān)。3) HBcAlB度的高低可反映病毒感染的狀態(tài)高濃度的抗-Hbc提示乙肝性感染， 恢復(fù)期濃度降低。慢性乙肝呈抗Hbc持續(xù)高濃度。而低濃度的抗Hbc一般為恢復(fù)期或既 往感染。4) 有利于對慢性肝炎活動性或非活動性的判斷。 非活動性慢性乙肝各項(xiàng)指標(biāo)相對穩(wěn)定，活動性往往呈現(xiàn)進(jìn)行性變化。3、TRFI掰口定量PC技術(shù)可互相補(bǔ)充血清HBDN微光定量PCRM定可以直接反映血液中病毒復(fù)制狀態(tài)具有很多臨床應(yīng)用價 值，但不能完

11、全反映病毒復(fù)制靜息期肝細(xì)胞陶BVW毒犬態(tài)。HBV-DNAB生并不完全代表體內(nèi)HBe被清除，結(jié)合“兩對半”各項(xiàng)指標(biāo)更能客觀反映體由B病毒狀態(tài)。4、 HBsAb勺定量測定能夠?qū)σ腋蔚念A(yù)防起到監(jiān)督作用HBsAb的定量測定能夠?qū)贵w是否真正具有“中和'HBV勺免疫力作出正確評價，對乙 肝的預(yù)防起到監(jiān)督作用。HBsAb勺含量在10mlU/ml以上病人ELISA檢測即可呈陽性結(jié)果， 但并不提示機(jī)體都一定具有免疫力，加BsAb勺含量在10- 100mlU/ml之間的樣本，定性 雖為“陽性”，但此日t機(jī)體對HBV勺免疫力較弱，甚至不能預(yù)防HBVg染。只有HBsAb勺含 量達(dá)到100mlU/ml以上時才

12、可確定具有抵抗HBV%侵的作用。作定量檢測，可根據(jù)HBsAb 的含量判斷機(jī)體對HBV勺免疫狀態(tài)及乙肝苗的免疫效果因此定量測定對乙肝疫苗免疫力的 評價和高危人群預(yù)防免疫具有重要意義，特別是在少年兒童預(yù)防乙肝方面。乙肝兩對半定量的臨床意義1、 乙肝表面抗原（ HBsA）g 定量能極早地檢出HBsAg確證乙肝感染，幾乎能與preSl同時檢測出。在乙肝病程中 大大縮短了窗口期的時間。由于機(jī)體常缺乏對包膜蛋白的免疫應(yīng)答HBsAgg達(dá)較低，可出現(xiàn)HBsAgAnti-HBs 均陰性的情況，定量檢測HBsA則可避免這些情況的出現(xiàn)。病毒發(fā)生變異后，病毒表達(dá)量較低，甚至 “定性”檢測不出抗原。 可檢測出HBsA，

13、g并極有可能同時檢測出HBsA、g Anti-HBs。國內(nèi)外學(xué)者研究表明HBsAg的細(xì)胞免疫應(yīng)答與肝細(xì)胞損傷有一定關(guān)系。血清中 HBsA畬量和病人對HBsAg田胞免疫成反比關(guān)系，而肝功能改就則與此種細(xì)胞免疫成反 比。而定量檢測HBsAg反映這一關(guān)系的唯一手段。一般來說，慢性肝炎HBsAgCOl對恒定：而活動性肝炎HBsAgCOE往較高且不穩(wěn) 定。2、乙肝表面抗體（Anti-HBs）定量Anti-HBs的定量檢測能夠地機(jī)體是否真正具有“中和'HBV疫力作為正確評價,避免誤誤導(dǎo)病人，對乙肝的預(yù)防起到監(jiān)督作用。Anti-HBs含理在1A100IU/L之間的樣本，乙肝兩對半定性的結(jié)果為陽性，但

14、此 時機(jī)體對HBV無中和作用，仍有感染HBV勺危險。只有定量檢測Anti-HBs在100UI/L 以上時才具有抵抗HB隊(duì)侵的作用。因此，定量檢測乙肝兩對半對乙肝疫苗免疫力的 評價和高危人群預(yù)防具有重要意義。3、乙能e抗原（HBeAg定量HBeAg乙肝病毒在肝細(xì)胞在繁殖時出現(xiàn)的tC/C基因的產(chǎn)物，經(jīng)蛋白酶水解后HBe 蛋白質(zhì)以非顆粒形式分泌入血清中。在急用BV®染時，血清中可出喇BeAg但維持 可測水平的時間很短暫（數(shù)天一數(shù)周HBeA4日性一般是提示有大量病毒存在，是急 性乙肝恢復(fù)期的首選血清學(xué)指標(biāo)。由前C基因突變HBV®染所致的急性或慢性乙肝，始終不HHBeAg但HBV-D

15、NA 行性復(fù)制。HBeA亦在高COI水平波動。與前者HBeAg日性慢性乙肝類型中的轉(zhuǎn)換期比 較，兩對半定性均表現(xiàn)為小三陽，但后者主要表現(xiàn)在AHBeAgCOI,忽高忽低的ALT 值和HBV-DNA終陽性。4、乙肝e抗體（Anti-HBe定量由HBV予型株感染所引起的急性或慢性乙型肝炎，其自然史分枷BeAgB性期和 Anti-HBe陽性期。定量監(jiān)測能明確出HBeAg Anti-HBe換的時期，即表現(xiàn)為HBeAgCOI 下降（含量降低）和Anti-HBeCOFT降（含量升高）的過程。因此,Anti-HBe定量與 HBeAgt量聯(lián)合中測對監(jiān)測HBV®染的病程及藥物的療效觀察有很好的實(shí)際意義。

16、由前C基因突就株HBV染所致異型慢性乙肝，由于患者始終不出現(xiàn)HBeAg因此， 長期監(jiān)測患者Anti-HBe含量對判斷其預(yù)后和轉(zhuǎn)歸具有十分重要的價值。5、乙肝核心抗體（Anti-HBc）定量乙肝病毒由外殼HBsA酢口內(nèi)核HBcA理成。乙肝病毒感染期間，一般會產(chǎn)生 Anti-HBc,在HBcAgB現(xiàn)后即可從血清中檢測到。偶爾也都nti-HBc陰性的HB播染 者，多見于免疫抑制的病人。在乙肝感染康復(fù)者HBsA疆帶者中，Anti-HBc可長期存在。因此，在特殊人群中 開展Anti-HBc篩選試驗(yàn)對預(yù)防乙肝的傳播有重要參考價值。Anti-HBc定量懷其他HBV式驗(yàn)一同檢測有助于乙肝感染的診斷和監(jiān)測。在其

17、他指 標(biāo)缺乏的情況下（如HBsAgR性），Anti-HBc定量可能是現(xiàn)存HBV染的唯一指標(biāo) 時間分辨免疫熒光法檢 測 乙型 肝炎病毒標(biāo) 志物臨床工作中發(fā)現(xiàn)少部分經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 檢測僅乙型肝炎表面抗原（ HBsA）g和抗HBc IgGf日性的患者，病毒含量卻很高。為此，采用時間分辨免疫熒光分析法TRF 對34例此類患者進(jìn)行乙型肝炎標(biāo)志物HBV M的檢查，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：1、 資料與方法1 . 病例選擇：為2002年2月至 9月住院或門診患者，共34例，男21例，女13例，年齡558歲，平均（29.2±18.7）歲。采靜脈血分離血清，用ELISA®行HB標(biāo)志物

18、（HBV M檢測及HBV DNA量檢查。留取血清量30c保存。（1） HBsAg抗HBc IgG陽性，乙 型肝炎e抗原（HBeA&抗-HBs抗-HBcIgM陰性；（2） HBV3N給量104拷貝/ml; 近3個月未使用抗病毒藥物。每人進(jìn)律次抗原抗體檢查，結(jié)果一致。2次HBNDN能查， 結(jié)果相差 1 個數(shù)量級以下。2 .常規(guī)HBV M僉測：用ELISA法，試劑為上?？迫A生物工程股份有限公司產(chǎn)品，按 產(chǎn)品說明書操作。3 .HBV DNA含理測定：采用實(shí)時熒光定量PCFfe,試劑盒購自廣州中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安 基因診斷中心。儀器為美國Perkin Elmer公司Gene Amp E5700PC取

19、。嚴(yán)格按說明書 操作，檢測靈敏度為 103拷貝 /ml 。4 .TRF法檢查HBV M試劑為上海新波生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，采曬nytest2000 時間分辨檢測儀。嚴(yán)格按照說明書操作。5 .統(tǒng)計(jì)分析：取HBV DNA量的對數(shù)值進(jìn)行成組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)比較，街檢驗(yàn)。2、 結(jié)果1 .HBV M :用TR聯(lián)檢查發(fā)現(xiàn)，34例患者中HBsAg HBeAg抗-HBc陽性者15例， HBsAg抗-HBb抗-HBct勻陽，性者14例，僅HBsAg抗-HBc陽性者5例。即用ELISA僉 查時HBeA垠陰性15例，抗-HB峨陰性14例（表1）。2 .HBV DN編量：HBeA或抗-HBc均陰Ti組、HBeAg日性

20、組、抗HBc陽性組HBV DNA 含量的對數(shù)平均值分別為 6.45± 1.74、 7.29± 1.59、 5.80± 1.46。將前者與后兩組分別進(jìn)行成組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)比較的檢驗(yàn)，t值分別為1.005、0.816, P值均0.05,差 異無顯著性。3、 討論HBW的變化是評估HBV染后病情轉(zhuǎn)歸的重要依據(jù)，也是抗病毒治療的療效考核指 標(biāo)之一。通過TRF檢查發(fā)現(xiàn)，大部分ELISA法檢測為HBsAg抗-HBc陽性模式的患者其 實(shí)為HBeA垠陰性（15/34, 44.12%及抗HBef段陰性（14/34, 41.18%。僅少部分可能 為病毒變異的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn),HBsA

21、g抗-HBc濃度顯著高于正常，ELISAMTRF#全率 為100%抗-HBs濃度明顯低于正常，兩者符合率為00%而HBeAg抗HB我度僅稍高 于正常，因此ELISA易出現(xiàn)假陰性。目前TRF主要用于激素的檢測。隨著儀器及試劑的 國產(chǎn)化，檢測費(fèi)用的降低,TRF0其突出的高敏感性、特異性強(qiáng)、無放射污染等特點(diǎn)，在 HBV M）檢測中有著廣泛的應(yīng)用前景。作者單位：410011長沙，中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院肝病研究中心目前我院已正式開展了乙肝二對半的時間分辨定量分析，其每一項(xiàng)的正常值范圍均是由我國衛(wèi)生部根據(jù)美國雅培的標(biāo)準(zhǔn)而制定，其靈敏度，準(zhǔn)確度，及精確度都有遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于一般的ELISA&,乙肝兩對半的定量制

22、定將給臨床提供一個關(guān)于乙肝診斷及療效，預(yù) 后判斷的更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。時間分辨熒光免疫定量測定乙肝兩對半的臨床意義極大地提高了檢測的靈敏度時間分辨熒光免疫定量技術(shù)TRFIA檢測HBsA錄敏度可達(dá)0.2ng/ml,而酶標(biāo)（EIASA檢測的靈敏度是 2ng/ml, 極大地提高檢測的靈敏度。因此，在急性乙肝早期能及早檢出HBsAg確證HBV®染，縮短窗口期；其次，可發(fā)現(xiàn)低濃/BsAgg帶者；在部分慢性乙 肝患者中，由于機(jī)體缺乏加BVfe膜蛋白的免疫應(yīng)答,HBsAgg達(dá)較低，酶標(biāo)檢測可出現(xiàn) HBsA鼻HBsAb勻陰性白情況，TR豉術(shù)則可避免這些情況的發(fā)生為正確判斷病情提供 依據(jù)。能動態(tài)觀察療效

23、和監(jiān)測病情1 ）定量分析HBsA百口 HBsA的濃度變化,可預(yù)見急性乙肝是否處于恢復(fù)期如HBsAg 濃度降低，HBsAtM度逐漸升高，可說明病懵正往恢復(fù)期發(fā)展；反之HBsA邪度處于 較高水平或上升趨勢，而HBsA，直處于較低水平，則易發(fā)展為慢性乙肝或病毒攜帶者。2 ）定量分析HBeA和HBeAb勺濃度變化，可反映病情變化和治療效果。定量測定 能明確檢測HBeAgg HBeAb專換的時期那表現(xiàn)為HBeA濃度下降和HBeA價高的過程。 高濃度的HBeAg®可以間接提示病毒處于高復(fù)制狀態(tài)，具有較高的傳染性.高濃度的 HBeAb-方面提示病情好轉(zhuǎn)，而在某些時候（如肝功能指標(biāo)很差）則可能與肝壞

24、死、肝 硬化、肝癌有關(guān)。3 ) HBsA濃度的高低可反映病毒感染的狀態(tài)。高濃度的加bc提示乙肝急性感染， 恢復(fù)期濃度降低。慢性乙肝呈抗Hbc持續(xù)高濃度。而低濃度的抗Hbc 一般為恢復(fù)期或 既往感染。4 )有利于對慢性肝炎活動性或非活動性的判斷。非活動性慢性乙肝各項(xiàng)指標(biāo)相對 穩(wěn)定，活動性往往呈現(xiàn)進(jìn)行性變化。 TRF府口定量PC或術(shù)可互相補(bǔ)充血清HBDN潢光定量PCRM定可以直接反映血液中病毒復(fù)制狀態(tài)，具有很多臨床 應(yīng)用價值，但不能完全反應(yīng)病毒復(fù)制靜息期細(xì)胞由BVW毒犬態(tài)。HBV-DNAm生并不完 全代表體內(nèi)HBg被清除，結(jié)合“兩對半”各項(xiàng)指標(biāo)更能客觀反映體的B病毒狀態(tài)。 HBsA酌定量測定能夠?qū)?/p>

25、乙肝的預(yù)防起到監(jiān)督作用嗎？HBsAb勺定量測定能夠?qū)贵w是否真正具有“中和HBV勺免疫力作出正確評價，對 乙肝的預(yù)防起到監(jiān)督作用。HBsA酌含量在100mlU/m以上病人ELISA檢測即可呈陽性 結(jié)果，但并不提示機(jī)體都一定具有免疫力，而BsAb勺含量在10- 100mlU/m之間的樣 本，定性雖為“陽性”，但此日t機(jī)體對HBV勺免疫力較弱，甚至不能預(yù)防HBM染。只 有HBsA的含量達(dá)到100mlU/m以上時才可確定具有抵抗HBVM旻的作用。作定量檢測， 可根據(jù)HBsAb勺含量判斷機(jī)體對HBV勺免疫狀態(tài)及乙肝疫苗的免疫效果。因此定量測定 對乙肝疫苗免疫力的評價和高危人群預(yù)防免疫具有重要意義，特別

26、是在少年兒童預(yù)防乙 肝方面。時間分辨熒光免疫分析在乙肝的應(yīng)用中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院肝病研究中心教授：楊旭乙肝抗原體測定是診斷乙肝最常用的方法。酶聯(lián)免疫測定由于操作簡便，成本低廉，敏 感性和特異性較好， 80年代中期以來就成為乙肝抗原體檢測最主要的方法。 但是本法只能定性， 作為定量測定的方法， 其重復(fù)性很差。 據(jù)觀察， 不同乙肝感染者表面抗原的濃度相差 800倍,e抗原的濃度相差100倍，僅用“陽性”來表示，實(shí)在太粗糙，太不科學(xué)，難以滿足臨床的需要。觀察指標(biāo)的量化是提高診斷水平的基本要求，也是科學(xué)發(fā)展的必然趨勢，因此，進(jìn)入 90 年代以來，國外先后推出第四代檢測方法：化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法。但是

27、這兩個方法需要昂貴的設(shè)備，試劑成本高，難以普遍應(yīng)用。為了滿足臨床的需要，根據(jù)國情和省情，我科瞄準(zhǔn)抗原抗體檢測發(fā)展的方向， 2002年 10 月引進(jìn)具有世界先進(jìn)水平的時間分辨熒光免疫檢測儀，在省內(nèi)率先建交時間分辨熒光免疫分析（TRFIA檢測乙肝抗原抗體的新方法，我院也是國內(nèi)少數(shù)應(yīng)用本法檢測乙肝的醫(yī)院之一。 時間分辨熒光免疫分析的原理和通常的免疫測定方法基本相同， 只是標(biāo)記物和測定方法不同。時間分辨熒光免疫分析以三價稀土離子（常用的是銪）及其螯合劑代替同位素、熒光素或酶，作為標(biāo)記抗原或抗體的示蹤物，檢測未知的抗體或抗原，用特制的時間分辨熒光儀測定最后反應(yīng)產(chǎn)物中熒光的強(qiáng)度， 根據(jù)熒光強(qiáng)度來判斷待測物

28、質(zhì)的濃度。 在免疫復(fù)合物中的稀土離子自身可產(chǎn)生微弱的熒光信號， 而當(dāng)加入增強(qiáng)液以后， 稀土離子從免疫復(fù)合物中釋放出來， 受到激發(fā)光照射時， 熒光強(qiáng)度可增強(qiáng) 100萬倍。 稀土離子發(fā)出性熒光不僅光度強(qiáng)，而且壽命長。反應(yīng)系統(tǒng)中許多物質(zhì)也可以發(fā)出熒光，但他們的熒光的壽命極短，因此，通過簡單的延時檢測， 就可以將特異性熒光與非特異性熒光區(qū)別開來， 所以這個方法的名稱冠以“時間分辨” 。時間分辨熒光免疫分析是一種超靈敏的高度特異性的檢測技術(shù)，是今后抗原抗體檢測發(fā)展的方向，其靈敏度比化學(xué)發(fā)光和電化發(fā)光高10倍100倍，比放免法和酶標(biāo)法高 1000倍以上。據(jù)我科現(xiàn)場測評，其特異性、敏感性和重復(fù)性均極強(qiáng)，幾乎

29、沒有假陰性，假陽性率低于0.1%同一標(biāo)本連續(xù)20次檢測CV1%同一批（10個）連續(xù)3天檢測CV=）.9% 檢測后反應(yīng)板連續(xù)3天重復(fù)閱讀CV： 1%這一方法的建立必將極大的提高我科的乙肝診斷水平，使我們對乙肝感染者的病情、預(yù)后、病毒復(fù)制程度、抗病毒藥物的療效等的判斷更變科學(xué)。乙肝時間分辨熒光免疫分析試劑盒共 5 項(xiàng)，包括表面抗原、表面抗體、 e 抗原、 e 抗體和核心抗體，可任選1 項(xiàng)或多項(xiàng)，全套需備血3ml (不加抗凝劑)，記賬后(每項(xiàng)45元)標(biāo)本送傳染科實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)天下午出結(jié) 果。時間分辨熒光免疫測定技術(shù)在HBS M定量檢測及臨床應(yīng)用分析【摘要】目的 研究乙肝病毒感染者血清免疫學(xué)標(biāo)志物，利用時

30、間分辨熒光免疫分析技術(shù)(TRFIA檢測其含量結(jié)果與ELISAS結(jié)果的任合程度、靈敏度、特異性；了解RFIA 測定HBV-M)準(zhǔn)確性、可行性及臨床應(yīng)用價值。方法分別用TRFIAF口 ELISA&測定260 例隨機(jī)血清標(biāo)本HBV-郵果及含量。結(jié)果HBsAgELISA)陽性36例，TRFI郊日，性40例， x2=4,P<0.05,兩法符合率98.46%抗-HBs(ELISA陽性 130性,TRFI郊日，性 160例,x2=3Q P<0.01,兩法符合率88.5% HBeAg(ELISA)性 17例,TRFI郊日，性 18例，x2=1, P>0.05, 兩法符合率99.6%

31、抗-HBe(ELISA)日性 86例，TRFIA®，性 73例,x 2=6.76, P<0.01, 兩法符合率90.4% 抗-HBc(ELISA)日性 54例，TRFI郊日，性 72例，x2=15.6 , P<0.01, 兩法符合率91.5%論TRFIA&與ELISA法比較，特異性、敏感性都高,TRFIA乍用 于HBV-的量檢測可為臨床間接反映病毒的感染狀況，同時也為臨床療效提供動力學(xué)觀 察及接種乙肝疫苗提供依據(jù)。關(guān)鍵詞HBV-附間分辨熒光免疫分析技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1606-8106 (2004 06-0486-02The time-

32、resolved fluoroimmunoassay TRFIA used in the HBV-M ration test and the analysis on clinical application Cai YiheDepartment of Laboratory,Chaozhou Central Hospital,Guangdong521021.Abstract 】 Objective to study the substance of blood immunityHBV-M,Applying,the technology of TRFI -A to test the result

33、and then compare itwith the result of the ELISA in fixness,sensivity and specificity and to compre-hcnd the accuracy,feasibility and the value of clinical application in testing HBV-M by TRFIA.Metfods to deter-minate the result and content of260and HBV-Mby TRFIAandELISArespectirely.Results HBsAgposi

34、tre is36by ELISA,and40by TRFIA, x2=4,P < 0.05,the fix rate is98.46%;anti-HBs positive is130by2ELISA,and160bT RFIA,x =30, P<0.01; the fix rate is88.5%; HBeApositive is17by ELISA,and18byRFIA,x2=1,P>0.05; the fix rate is99.6%; Anti-HBepositive is86by ELISA,and73by TRFIAx2=6.76, P<0.01, the

35、fix rate is90.4%; Anti-HBc positive2is54by ELISA,and72bTRFIA,x =15.6 , P<0.01, the fix rate is91.5%.Con-clusion TRFIA has higher specificity and sensitivity than ELISA,TRFIA in testing HBV-M content mayindirectly neflect the virus infection in clinical andoffer dynamics observation in the clinica

36、l iffects and basis in inoculation a-gainst HBV.Key words HBV-M TRFIA ELISA時間分辨熒光免疫測定技術(shù)在HBV-M定量檢測及臨床應(yīng)用分析目前國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室最常用的乙型肝炎病毒HBV感染者的血清學(xué)標(biāo)志物檢測主要 靠ELISA&,由于ELISAS簡單、方便、快速的優(yōu)點(diǎn)在臨床得到廣泛應(yīng)用，但受方法學(xué) 本身的限制，它不能提供HBV-M勺具體含量，只能作為陰陽性判斷，故不可能完成BV 感染的動力學(xué)觀察，而時間分辨熒光免疫技術(shù)的出現(xiàn)提供了對BV-MI行定量檢測的手 段。本文采用TRFIA法對260份血清標(biāo)本進(jìn)行HBV-松測，并

37、與ELISA&結(jié)果進(jìn)行比較 和分析。現(xiàn)報告如下：1 對象與方法1.1 對象 血清標(biāo)本均來自本院門診及住院病人260例， 無年齡性別要求。 早晨空腹抽取靜脈血，分離血清后產(chǎn)即檢測。1.2 檢測試劑ELISA試劑盒由上海榮盛生物技術(shù)有限公司提供。TRFIA式劑盒由廣 州市豐華生物工程有限公司提供。1.3 儀器EL-312e酶標(biāo)儀。泰萊1時間分辨熒光分析儀。Egate231準(zhǔn)自動洗滌。 2510變頻振蕩器。1.4 質(zhì)控物 由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供。1.5 方法ELISA法和TRFIA&測定HBV-M嚴(yán)格按照試劑操作規(guī)程操作，同時加入 相應(yīng)質(zhì)控物監(jiān)測。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用配對x2 檢

38、驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 HBsAg ELISA法結(jié)果陽性36例，陽性率13.8% TRFIA法結(jié)果陽性40例，陽性 率15.4%兩法都陽性36例，兩法都陰性220例，TRFI郊日性而ELISA#性4例，TRFIA 陰性而ELISAffl性無，采用配對x2檢驗(yàn)，x2=4,P<0.05,差異有顯著性，兩法比較符合 率為 256/260=98.46%M中 HBsAg含量 0.55ng/ml 占 4 例，625ng/ml 占 7 例，26- 50ng/ml 占 8 例，5150ng/ml 占 8 例，150ng/ml以上占 13例。2.2 抗-HBs ELISAt結(jié)果陽性130例，陽性率50% TR

39、FIA&結(jié)果陽性160例，陽性率 61.5%兩法都陽性130例，兩法都陰性100例，TRFIAWi而ELISA#性30例，TRFIA 陰性而ELISAffl性無，采用配對X2檢驗(yàn)，x2=30,P<0.01,差異有非常顯著性，兩法比較 符合率為 230/260=88.5% 其中-HBs含量 10100mIU/ml占 79 例，10200mIU/ml占 16例，201 1000mIU/m占46例，1000mIU/m以上占 19例。2.3 HBeSg ELISA法結(jié)果陽性17例，陽性率6.5% TRFIA法結(jié)果陽性18例，陽 性率6.9%兩法都陽性17例，兩法都陰性242例，TRFI4

40、日性而ELISAS性1例，TRFIA 陰性而ELISAffl性無，采用配對x2檢驗(yàn)，x2=1,P>0.05,差異無顯著性，兩法比較符合 率為 259/260=99.6%其中 HBeS畬量0.030.1NCU/m臼 1 例，0.11 0.5NCU/m占 4 例，0.51 2NCU/ml1例，2.1 8NCU/ml1例。2.4 抗-HBe ELISAS結(jié)果陽性86例，陽性率33% TRFIA法結(jié)果陽性73例，陽性 率28%兩法都陽性67例，兩法都陰性168例，TRFIATO性而ELISA陰，性6例，TRFIA 陰性而ELISA陽，性19例，采用配對x2檢驗(yàn)，x2=6.76,P<0.01

41、,差異有非常顯著性，兩 法比較符合率為235/260=90.4快中抗-HB給 量 1.5 2NCU/ml14,2.1 5NCU/ml14 例，5.1 10NCU/ml23, 20NCU/mU上24例。2.5 抗-HBc ELISA&結(jié)果陽性54例，陽性率20.8% TRFIA&結(jié)果陽性72例，陽 性率27.7%兩法都陽性52例，兩法都陰性186例，TRFI郊日性而ELISA陰，性20例， TRFIA1性而ELIS郊日，性2例，采用配對x2檢驗(yàn)，x2=15.6,P<0.01,差異有非常顯著性， 兩法比較符合率為238/260=91.5%其中抗-HBc含量0.10.5NCU/

42、ml11例，0.51 1NCU/ml例，1 5NCU/ml1例，5.1 10NCU/ml3例，10NCU/milZ上 14 例。3 討論TRFIA法檢測HBV-MT ELISA®相比，其特異性和敏感性都高,特別是能夠檢測低濃 度HBsA和HBeAg對減少HBV染漏診和誤診具有較高價值。EHBsAg日性是HBVg 染的金標(biāo)準(zhǔn)二有學(xué)者對血清呈低水平存在血清HBsA的在5ng/ml以下者做過研究2、 對象是非肝炎患者住院人群，結(jié)果是占總?cè)巳旱?34%占HBsAgm生人群的23.16% 而本文只檢測出1.5騎口 10%此結(jié)果存在一定差異，有待進(jìn)一步探討。揀Bs是對HBV 的保護(hù)性免疫指標(biāo)，有

43、學(xué)者認(rèn)為仍有保護(hù)作用的最低揄Bs的濃度為10mIU/ml提出基礎(chǔ)免疫后高度抗體滴度的再接種方案最后一次接種后4周，如抗-HBs< 10mIU/m立 即再接種；10100mIU/m 36個月后必須再接種工 實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)抗HBs定量檢測對于監(jiān)測、指導(dǎo)肝移值中乙型肝炎免疫球蛋白的應(yīng)用具有肯定作用。說明了對抗-HBs定量的檢測是很有必要的， 同時也可了解人體是否有抗-HBs、 是否有足夠的量可抵御HBV的侵襲。本文抗HBs結(jié)果顯示，160例TRFIA法陽性79例，抗-HBs濃度值在10- 100mIU/m以內(nèi)，此量因無確切的抵御能力，建議加強(qiáng)預(yù)防措施。對于-HBs陰性的人 群更應(yīng)做好預(yù)防，至于

44、100mIU/m以上含量的人群，說明他們已有好的抵御能力。另外 結(jié)果提示，ELISAS抗-HBe陽性率明顯高于TRFIA&,由于本身方法學(xué)的限制，最好 在發(fā)出報告時加以綜合分析或提高 Cutoff 值。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HBV-咯項(xiàng)陽性結(jié)果都顯示了不同的含量，說明了人體感IHBV 后，病毒的復(fù)制程度或經(jīng)抗病毒藥物治療后,HBV-暗量也隨之變化，提示了動力學(xué)關(guān) 系。據(jù)所掌握的資料觀察，患都治療前及治療周BV-婚量變化結(jié)果比較。見表1。表1 2例病人HBV-MB療前后結(jié)果比較 略可以看出，HBsAgj口 HBeA地漸下降，而所有抗體逐步增高，這說明抗病毒治療是 有效的，同時也給臨床預(yù)后判斷提供

45、了依據(jù)。目前臨床上對檢測HBV-M勺血清常用方法是血清免疫學(xué)檢測，也就是檢測患者對 病毒侵染機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，因此免疫血清學(xué)指標(biāo)可間接反映病毒的感染狀況。隨著檢測水平的不斷提高，TRFIA技術(shù)的問世給免疫自身的研究和發(fā)展提供了新的手段。雖 然DN麋直接反映病毒本身在機(jī)體內(nèi)的存在情況，而人們越來越意識到兩者既相關(guān)，又 不盡一致，高靈敏準(zhǔn)確的HBV-Mt量結(jié)果可與HBV-DNA檢測相互印證，給臨床提供更 客觀有效的實(shí)驗(yàn)報告，臨床上需要將兩者結(jié)合起來對患者進(jìn)行綜合診斷、治療和預(yù)后等判斷。如果在沒有開展HBV-DNA目檢測的單位，HBV-喻量檢測其本身也就是一個很好監(jiān)測病毒動力學(xué)變化的輔助指標(biāo)。參考

46、文獻(xiàn)1、 陳紫榕，病毒性肝炎，北京：人民衛(wèi)生出版社，2002， 6， 191.2、 陳瑜，鐘步云，徐根云，等. 低水平血清乙肝病毒表面抗原測定及臨床意義。中華檢測醫(yī)學(xué)雜志，2001， 24： 1.3、 Klaus-peter Maier 著，郝連杰等譯. 第四版；北京人民衛(wèi)生出版社，1997， 8，35。作者單位：521021廣東省潮州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科關(guān)于乙肝病毒標(biāo)記物“兩對半” 定量測定和肝功能（肝纖維化）檢測的通知各臨床科室：為增加我院臨床診斷、治療和觀察病情的參考依據(jù)，進(jìn)一步提高我院的醫(yī)療水平和我院的綜合競爭能力。我們要積極開展應(yīng)用技術(shù)、新項(xiàng)目。最近檢驗(yàn)科在院領(lǐng)導(dǎo)的大力支持下引進(jìn)了 WA

47、LLAC司生產(chǎn)的時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)，該時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)可進(jìn)行多種檢測（見附錄）其中對“乙肝兩對半”可進(jìn)行準(zhǔn)確的定量測定。歡迎各臨床科選用醫(yī)務(wù)科2002年 12月 25 日一、兩對半定量測定乙肝病毒（HBV標(biāo)記物的檢測方法常用測定乙肝病毒的抗原、抗體標(biāo)記物，60年代 末70年代初的瓊脂擴(kuò)撒法，依次發(fā)展為血凝法一酶聯(lián)免疫吸附ELISA、同位素免疫 標(biāo)記（RIQ -化學(xué)發(fā)光免疫分析、生物發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光免疫標(biāo)記和0年代中建立的 稀土離子熒光標(biāo)記（時間分辨熒光免疫分析）等不同的檢測方法。隨著科學(xué)的發(fā)展和檢 驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，具方法每發(fā)展一步，乙肝標(biāo)記物檢出的靈敏度和準(zhǔn)確性都得到不同的提 高（

48、其中 RIA為 1012mol/L、ECL 1防 1019 mol/L、CLIA為 1015m ol/L、ECL1時-17/1_、 TRF為1019 mol/L）。其中時間分辨熒光免疫分析TRF為近年新研制成功的用三價稀 土離子作為示蹤物，以單克降抗體包被支持物與樣品中抗原反應(yīng)，再加入有徒U標(biāo) 記的抗體，進(jìn)行反應(yīng)檢測，可大大降低一般同位素和熒光標(biāo)記受環(huán)境干擾缺點(diǎn)，提高了 檢測的靈敏和準(zhǔn)性，閔RFfe檢測乙肝病毒標(biāo)記物較其他方法靈敏度高、特異性好，因 干擾因素少可大地優(yōu)于以上各種方法，可*BV-DNA檢測相比（未經(jīng)規(guī)范化要求開展 的HBV-DNA測，多年的臨床實(shí)驗(yàn)證明，假陽性、假陰性率較高，重復(fù)

49、性差，且不能定 量。）TR叨目前檢測乙肝病毒標(biāo)記物最理想怕方法。TR淀量檢測乙肝病毒“兩對半” 為臨床診斷乙肝提供了新手段，有助于臨床客觀的分根BV®染情況、療效的觀察和轉(zhuǎn) 歸等情況的分析，至少可對一列情況更具有獨(dú)特的診斷價值：1、治療前進(jìn)行病毒定量檢測，可以指導(dǎo)選擇抗病毒藥物，避免盲目用藥。2、 治療后定量間接判斷體內(nèi)病毒數(shù)量，有助于療效的觀察。3、 懷孕前進(jìn)行定量測定，有助于選擇有利的懷孕時機(jī)。乙肝孕婦進(jìn)行定量檢查， 有助于使部分病人得到及進(jìn)的正確的診斷二、兩對半定量與定性組合測定今后檢驗(yàn)科對乙肝“兩對半”檢查，可給臨床提供兩種選擇，一種是乙肝病芾項(xiàng)定量測定；另一種是定量與定性組

50、合檢查，即在乙肝“兩對半”的五項(xiàng)檢查HbsAg（表面抗原）、抗-HBs （表面抗體）、，HbeAg（E-R抗原）此3項(xiàng)重要的指標(biāo)中必須有一項(xiàng)是定量的（其余4 項(xiàng)定性；也可選擇其中 2 項(xiàng)做定量，其余3 項(xiàng)做定性） 。任上臨床根據(jù)病人的經(jīng)濟(jì)情況選擇，但如果臨床不注明，檢驗(yàn)科一律做bsAgt量與其余4定性檢查。5項(xiàng)定量測定收費(fèi)105元， 1 項(xiàng)定量與其余4項(xiàng)定性檢查收費(fèi) 45元。此舉意義使“兩對半”檢查得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果與及更好解釋和發(fā)揮“兩對半” 檢查的臨床意義；使臨床檢查“兩對半”有更多、更切合患者利益選擇，如病人經(jīng)濟(jì) 許可，可選擇5項(xiàng)定量測定，如果經(jīng)濟(jì)困難即可注明選擇其中 1 項(xiàng)與其它 4定

51、性檢查。此種組合合理，檢查意義大，符合國家循征醫(yī)學(xué)的要求。（“兩對半”定量檢查，收費(fèi)105元，如同時做生化全套，開檢驗(yàn)單時請分開單，如“兩對半”為 1 項(xiàng)定量其余 4 項(xiàng)為定性檢查在一張檢驗(yàn)單同時申請即可。 ）南通醫(yī)學(xué)院 論著甲胎蛋白、癌胚抗原時間分辨熒光法與化學(xué)發(fā)光法比較王桂蓮 朱利國 黃飚蔡剛明 譚成金堅(jiān) 單位： 江蘇省江原醫(yī)院， 無錫241063關(guān)鍵詞：時間分辨熒光免疫分析；化學(xué)發(fā)光免疫分析；甲胎蛋白；癌胚抗原摘要DTP越制備了 Ei3+標(biāo)單抗，采用夾心法建交了 AF評口 CEA IFMA它們 的靈敏度分另I為43ng/L和90ng/L;批內(nèi)CV% 1.599嚨口 1.36% 批間CV%

52、 7.139% 和2.89%平均回收率為103.98%口 92.78%與CLIA進(jìn)行臨床應(yīng)用比較顯示結(jié)果高 度相關(guān)（ AFP r=0.9040,CEA r=0.9705） 。中圖分類號 O657.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1000-2057（2000）02-0159-01甲胎蛋白（AFP用癌月5抗原（CEA是迄今較為肯定的腫瘤標(biāo)志物;憶廣泛用于臨床 腫瘤診斷，兩者的檢測已有RIA EIA和IRM懵方法。近來發(fā)展的時間分辨熒光和化 2學(xué)發(fā)光測量技術(shù)，信噪比較高，分析靈敏度超過了上述方法2 。我們在完成了AFP、CE島口 IRMA：作的基礎(chǔ)上，采用時間分辨熒光測量技術(shù)，建交了時間分辨免疫熒光分

53、析 ( Time-resolved Immunofluormetric assay,IFMA) ， 并與 化 學(xué) 發(fā) 光 免 疫分 析 (Chemiluminescence Immunoassay,CUA4 行比較。1 材料與方法1.1 試劑與設(shè)備抗CEAB抗G7和Go,抗AFPH抗137#和47#由無錫市第二制藥廠提供。E；+標(biāo)記盒(1244-302, E發(fā)光增強(qiáng)液(B118-110、AF壞口 CEA 參考標(biāo)準(zhǔn)，EG&G-Wellac產(chǎn)品。二乙烯三胺五乙酸酊(DTPR SigmaT品。PD-10 和 Sepharose CL-6B,Pharmeci產(chǎn)品。CA-19-9 CA-12-5

54、和 CA-15-3參考標(biāo)準(zhǔn)， AF環(huán)口 CEA CLI貓盒，CIBA-CORNINW。牛IgG自制。去離子超純水由本室 采用Barnsteed公司超純水器(D7033制備。96孔微扎板，Nunc產(chǎn)品。BSA 上海生物制品的產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。全自動IFMA檢測儀(Auto DELFIA1235 為 EG& G-Wellac 產(chǎn)品。全自動 C L I A 檢測儀(AC S 1 8 0 ) 為C I B ACORN I NG產(chǎn)品。1 . 2方法1.1.1 C E A IFMA ( 1 )固相 Ci7 和 Ei3+- C5 o 制備：將 Ci7 單抗用 5 0 nmol/L Na

55、2CNaHC3Ph9.6釋至 1 0 mg/L 每孔加 200ul,4 c放置過夜。 Eu3+-C5 o制備參照Ei3+標(biāo)記盒進(jìn)行。每個C5 o IgG上連接了 13個ElT,產(chǎn)率 達(dá) 52.6% (2)測定方法：用含 8mmol/L NaCI,0.1%BSA,0.2%牛 IgG, 50umol/LDTPA,0.1ml/LTween-8和 0.1%NaN 50mmol/L Tris-HCI ph7.8 為 反應(yīng)沖液，以含 14.5 水 mmol/L NaCI,0.2ml/L Tween-8價口 0.2%NaN勺上述緩 沖液為洗滌液采用固相二步順序夾心法建立CEA-IFMA,p在包被有的96孔微

56、孔板上 , 每孔依次加入 25ul CEA 參考標(biāo)準(zhǔn)或待測血清及200ul 反應(yīng)緩沖液,37 C振蕩孵育2h后,用洗滌液洗4次。再加200ul1:1000稀釋的Eu3+-C5 0 , 37c卵?育1兒洗滌6次，加入增強(qiáng)液200ul,370170反應(yīng)5min,熒光檢測。全部 過程在Auto DELFIA1235b自動完成。1.1.2 AFP IFMA (1)固相C47和Ei?+Q37制備：方法同上，每個CgG上 3+連接了 7.52個Eu ,廣率達(dá)53.07% (2)測定萬法：反應(yīng)緩沖收和洗滌收同 上。采用固相二步順序夾心法建交AFP-IFMAC47包被板每孔依次加入25ul AFP 參考標(biāo)準(zhǔn)或

57、待測血清及200ul反應(yīng)緩沖液，37c卵?育1h后，加200ul: 1000 稀釋的EL3+-C5 o，孵育1h。后續(xù)方法同上。1.1.3 CEA和AFP CLIA參照藥盒說明書，全部過程均在ACS180t自勸完成。2 結(jié)果2.1 CEA IFMA以零劑量測量結(jié)果均值加上0.2S代入標(biāo)準(zhǔn)曲線分析,CEA IFMA 的靈敏度為90ng/L; AFP寸本法無交叉反應(yīng)，CA-19-9的交叉反應(yīng)可達(dá)2.81% 方法的批內(nèi)和批間CV分另J為1.36崎口 2.89%平均回收率為92.78%可測范 圍為 1.45 508.9ug/L。2.2 AFP IFMA以零劑量測量結(jié)果均值加上0.2S代入標(biāo)準(zhǔn)曲線分析A

58、FP IFMA 的靈敏度為43ng/L; CEA CA-12-5 CA-15-3和CA-19-9對方法無交叉反應(yīng)； 方法的批內(nèi)和批間CVMI為1.599嚨口 7.139%平均回收率為103.98%可測 范圍為 4.22 1210ul/L。2.3 IFMA與CLIA同步比較137例正常人經(jīng)CEAMA CLIA測量，結(jié)果高度相 關(guān)(r=0.9705)。148例正常人經(jīng)AFPFMA和CLIA測量，結(jié)果相符(r=0.9040)。 3 討 論以往超微量免疫分析技術(shù)應(yīng)用的普遍問題是穩(wěn)定性難以滿足于臨床工作的需要。鑒于放射性同位素示蹤劑自身衰變或保存條件苛刻及自分解變性失活等原因，對于RIA和IRMA?方法，每次分析，即使單樣品檢測也必須