BCA蛋白濃度測定

1、BCA蛋白濃度測定一、實驗原理：BCA(bicinchonininc acid)與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，一個Cu+螯合二個BCA分子，工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復(fù)合物，該水溶性的復(fù)合物在562nm處顯示最大吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。二、試劑盒說明：1. 檢測濃度下限達(dá)到10g/mL，最小檢測蛋白量達(dá)到0.2g，待測樣品體積為1-20L。在20-1000g/mL濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。2. BCA法測定蛋

2、白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達(dá)5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響，需確保EDTA低于10mM，無EGTA，二硫蘇糖醇低于1mM，-巰基乙醇低于0.01%。這些不適用BCA法的樣品，可以使用Bradford蛋白濃度測定法。注：雙向電泳裂解液中有較高含量的DTT，所以不能使用BCA法測定，或者是測完濃度上樣前再加入DDT。三、保存條件：A、B液室溫保存。蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制成溶液后-20凍存。四、操作步驟：1. 提前至少半小時打開紫外分光光度計或者酶標(biāo)儀。2. 配制25mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液

3、母液。取1.2mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到一管蛋白標(biāo)準(zhǔn)(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制后可立即使用，也可以-20長期保存。3. 配制0.5mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液取適量25mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)，稀釋至終濃度為0.5mg/mL。取20L25mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)，加入980L稀釋液即可配制成0.5mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)，并分裝到200L的離心管中，每管80L，-20長期保存，需要使用取出一管溶解后使用。注：蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見，也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。4. 配制BCA工作液按50體積BCA試劑A加1體積BC

4、A試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。根據(jù)樣品數(shù)量計算所需BCA工作液體積，每個樣品需要200L的BCA工作液，再加上標(biāo)準(zhǔn)品所需2mL，例如10個樣品，所需體積為0.2 mL×10+2 mL =4 mL，取4 mL BCA試劑A，加入80L BCA試劑B，混勻，配制成4.8mL BCA工作液， BCA工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。5. 將0.5mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20L加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20L。6. 加適量體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋補(bǔ)充到20L。注：測量濃度請需要對樣品進(jìn)行稀釋，使

5、其的濃度范圍在0.5-5 mg/mL之間，保證樣品濃度在線性范圍內(nèi)，一般樣品需要稀釋5-10倍即可，根據(jù)實際蛋白濃度適當(dāng)調(diào)整。7. 各孔加入200L BCA工作液，37放置20-30分鐘。注:也可以室溫放置2小時，或60放置30分鐘。BCA法測定蛋白濃度時，顏色會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應(yīng)會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或適當(dāng)延長孵育時間。8. 使用紫外分光光度計或酶標(biāo)儀測定A562吸光度，540-595nm之間的波長也可接受。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的蛋白濃度。 五、實驗數(shù)據(jù)及處理測得三次重復(fù)實驗BSA溶液的吸光度如下：用Excel或orgin作出吸光度對BSA濃度的關(guān)系曲線。六、實驗結(jié)果分析得到的吸光度對BSA濃度的關(guān)系曲線R2值大于0.99的時數(shù)據(jù)較好。如果R2值較小，即測得的吸光度與濃度的線性不是很好。究其原因可能有以下兩點：一是移液槍的操作不是很熟練，二是移液槍在移液過程中存在著氣泡，使移的液體體積不準(zhǔn)確。注意事項：建議每次