超抗原SEB活化耐受性NKT細(xì)胞亞群的研究

1、超抗原SEB活化耐受性NKT細(xì)胞亞群的研究                       作者：陳鈺, 鐘江 徐健, 陳中才, 郭業(yè)磊, 金婷, 張繼慧 【摘要】  目的: 探討超抗原SEB活化的效應(yīng)細(xì)胞參與免疫耐受的NKT細(xì)胞亞群及分化特征。方法: 采用C57BL/J小鼠脾細(xì)胞經(jīng)SEB誘導(dǎo), 收集體外擴(kuò)增10 d的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞, 與刀豆蛋白（ConA）

2、、 脂多糖（LPS）和白介素2（IL2）共同培養(yǎng)3 d, 測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞對(duì)刺激劑的應(yīng)答反應(yīng)能力。在正常小鼠淋巴細(xì)胞與上述刺激劑反應(yīng)的同時(shí)添加效應(yīng)細(xì)胞, 3 d后測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞抑制正常淋巴細(xì)胞對(duì)刺激原的應(yīng)答反應(yīng)能力。用MTT染色方法記錄細(xì)胞增殖的A值。以ConA活化的淋巴細(xì)胞做參照, 用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)解析了耐受性效應(yīng)細(xì)胞中NKT細(xì)胞亞群并顯示分化來(lái)源與功能的相關(guān)性。結(jié)果: 與正常淋巴細(xì)胞對(duì)抗原應(yīng)答反應(yīng)能力相比, SEB活化的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)ConA、 LPS和IL2的應(yīng)答反應(yīng)能力明顯降低, 細(xì)胞生長(zhǎng)的A值從正常組的0.80±0.04、 0.60±0.03和0.55±0.

3、07下降到0.60±0.05、 0.30±0.05及0.27±0.04 (P<0.01, n=3)。效應(yīng)細(xì)胞抑制正常淋巴細(xì)胞對(duì)上述抗原的應(yīng)答反應(yīng), 尤其抑制ConA 活化的T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng); A值分別由正常值降低到0.26±0.002、 0.48±0.04及0.34±0.02(P<0.01, n=3)。效應(yīng)細(xì)胞中CD4+NK1.1+、 CD8+NK1.1+、 TcRV8+/NK1.1+NKT細(xì)胞亞群顯著增加(P<0.05和P<0.01, n=4)。ConA活化的淋巴細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞并包括CD4-CD8-/C

4、D3+ NK1.1+ NKT細(xì)胞。結(jié)論: 超抗原SEB活化的耐受功能與CD4+NK1.1+、 CD8+NK1.1+、 TcRV8+NK1.1+NKT細(xì)胞亞群有關(guān), 它們由T細(xì)胞分化而來(lái)。 CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT細(xì)胞沒(méi)有參與耐受性調(diào)節(jié)。 【關(guān)鍵詞】  NKT細(xì)胞亞群; 超抗原; SEB; 免疫耐受    NKT細(xì)胞是以NK細(xì)胞和T細(xì)胞兩者為特征的, 僅占淋巴細(xì)胞群的1%1。NKT細(xì)胞的作用主要有兩個(gè)方面, 效應(yīng)功能和調(diào)節(jié)功能。它可以抑制Th1細(xì)胞的過(guò)激, 控制IL2, IFN的產(chǎn)生和后期的細(xì)胞增殖, 可以調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生,

5、 使T細(xì)胞分化朝Th2方向偏移; 它也可以在Th1細(xì)胞抵抗感染和腫瘤時(shí)提供幫助以及可以阻止部分細(xì)胞的分化, 控制自身免疫病的發(fā)生和2。越來(lái)越多的研究報(bào)道了NKT細(xì)胞有很多亞群3, 4, 但是仍不能區(qū)別不同亞群的不同功能以及它們的來(lái)源和分化途徑。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B（Staphylococcal enterotoxin B,  SEB）能誘導(dǎo)外周淋巴細(xì)胞生成效應(yīng)細(xì)胞, 這些效應(yīng)細(xì)胞具有明顯的抗排斥作用和免疫耐受特征, 并且均伴隨NKT細(xì)胞的增加5, 6。本研究用超抗原SEB在體外擴(kuò)增了具有耐受功能的效應(yīng)細(xì)胞, 對(duì)這些細(xì)胞的耐受調(diào)節(jié)特征、 細(xì)胞亞群以及在外周淋巴

6、系統(tǒng)生成的NKT細(xì)胞的分化途徑進(jìn)行了研究。    1  材料和方法    1.1  材料  C57BL/J小鼠（雌性, 質(zhì)量1820 g,  68周齡）來(lái)自解放軍第301實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心二級(jí)動(dòng)物房。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司, MTT染料（四甲基偶氮唑鹽3（4.5dimethyiazolzyl）2.5diphenyl tetrazolium bromide）、 ConA和LPS均購(gòu)自Sigma公司, 二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Solarbio 公司, 胎牛血清購(gòu)自北京軍區(qū)獸醫(yī)防治中心,

7、 IL2由解放軍302醫(yī)院病毒研究所惠贈(zèng); SEB（自主知識(shí)產(chǎn)權(quán), 專利號(hào): 00103991.4）; 抗CD3PerCP、 CD4FITC、 CD8PE、 NK1.1APC和抗TcRV8PE熒光抗體均購(gòu)自BD公司。    12  方法    121  正常小鼠淋巴細(xì)胞制備  摘取C57BL/J小鼠脾細(xì)胞在無(wú)菌臺(tái)前分離細(xì)胞, 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液, 經(jīng)紅細(xì)胞裂解, 洗滌2次后, 制備成密度為5×109/L個(gè)細(xì)胞的懸浮液待用。  &#

8、160; 122  SEB活化的耐受性效應(yīng)細(xì)胞制備  在25 mL培養(yǎng)瓶中加入1×109細(xì)胞/L, 隨后加入3.5 mL 400 g/L SEB混合后置37、  50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)5 d。洗滌換液后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)到第10天, 收獲細(xì)胞, 作為耐受細(xì)胞懸浮至5×109細(xì)胞/L用于抑制功能實(shí)驗(yàn)。    123  SEB活化的耐受性效應(yīng)細(xì)胞對(duì)刺激劑的應(yīng)答反應(yīng)  在96孔板中加入5×105細(xì)胞/(100 L/孔), 并分別加入0.1 mL ConA(10 mg/L),  0

9、.1 mL LPS(10 mg/L)和0.1 mL IL2（200 IU/mL）, 對(duì)照組加入培養(yǎng)液。在37、  50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)3 d后MTT染色, 570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定細(xì)胞增殖的A值。    124  SEB活化的耐受性效應(yīng)細(xì)胞抑制功能的測(cè)定  在96孔板中加入正常C57BL/J小鼠脾細(xì)胞5×105細(xì)胞/（100 L/孔）, 并在分別加入0.1 mL ConA(10 mg/L),  0.1 mL LPS(10 mg/L)和0.1 mL IL2（200 IU/mL）的同時(shí)加入SEB活化的效應(yīng)細(xì)胞5

10、×105細(xì)胞/（100 L/孔）。對(duì)照組為正常淋巴細(xì)胞分別加入上述相應(yīng)刺激原。在37、  50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)3 d后MTT染色, 570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定細(xì)胞增殖的A值。    125  SEB活化耐受性效應(yīng)細(xì)胞的T細(xì)胞和NKT細(xì)胞亞群解析  實(shí)驗(yàn)分為SEB和ConA兩個(gè)組。在96孔板中加入5×105細(xì)胞/（100 L/孔）, 并分別加入0.1 mL SEB(400 g/L)和0.1 mL ConA(10 mg/L),  在37、 50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。取培養(yǎng)第10天的細(xì)胞經(jīng)抗CD3

11、PerCP、 CD4FITC、 CD8PE和NK1.1APC以及CD3PerCP、 CD4FITC、 NK1.1APC和TcRV8PE熒光抗體四染色后, 用流式細(xì)胞儀（FACs Calibue BD,  USA）測(cè)定T細(xì)胞、 NKT細(xì)胞亞群增殖的百分?jǐn)?shù)并記錄NKT細(xì)胞亞群分化途徑。    126  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  計(jì)量資料用x±s表示。采用t檢驗(yàn)分析。所有數(shù)據(jù)均用CHISS統(tǒng)計(jì)軟件處理。    2  結(jié)果    21  SEB活化的耐受性效應(yīng)細(xì)胞對(duì)

12、刺激劑的應(yīng)答反應(yīng)性下降  用ConA、 LPS、 IL2分別刺激正常淋巴細(xì)胞或SEB活化效應(yīng)的細(xì)胞, 3 d之后MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖并記錄增殖的A值。SEB活化的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)ConA、 LPS和IL2的應(yīng)答反應(yīng)能力由正常的0.80±0.04,  0.60±0.03和0.55±0.07下降到0.60±0.05,  0.30±0.05及0.27±0.04 (P<0.01,  n=3,  圖1)。    圖1  SEB 活化的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)刺激劑的應(yīng)

13、答反應(yīng)    Fig 1  The response of the effecter cells by SEBactivated to several mitogens    eff.cells:  The effector cells by SEBactivated.  bP<0.01 vs control group.    22  SEB活化的耐受性效應(yīng)細(xì)胞抑制正常淋巴細(xì)胞對(duì)刺激劑的應(yīng)答反應(yīng)  正常淋巴細(xì)胞在分別加入ConA、 LPS、 IL2

14、的同時(shí)加入SEB活化的效應(yīng)細(xì)胞, 經(jīng)培養(yǎng)后, 正常淋巴細(xì)胞與刺激原的應(yīng)答反應(yīng)能力明顯受到抑制, 尤其抑制正常細(xì)胞與ConA的應(yīng)答反應(yīng)能力。細(xì)胞的增殖能力由正常值由正常A值0.80±0.04、  0.60±0.03和0.55±0.07下降到0.26±0.002、  0.48±0.04及0.34±0.02(P<0.01,  n=3,  圖2)。    23  SEB或ConA活化T淋巴細(xì)胞亞群的比較  在SEB活化的具有耐受功能的效應(yīng)細(xì)胞中CD

15、3+、 CD4+ T細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)分別由原始的27.52%和15.04%下降至18.74%和12.35%(P<0.01, n=4), CD8+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)略有增加, 由原始的16.11%上升到23.18%（P>0.05）, TcRV8+T細(xì)胞從10.55%上升到28.48%（P<0.01, n=4）。ConA活化的淋巴細(xì)胞主要是T淋巴細(xì)胞, 包括CD3+、 CD4+、 CD8+和TcRV 8+T細(xì)胞亞群。它們分別由最初的27.52%、 15.04%、 16.11%和10.55%上升到41.72%、 36.49%、 54.21%及25.86%（P<0.01, 

16、n=4, 表1)。表1  SEB或ConA活化的T細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)    24  SEB和ConA活化的NKT細(xì)胞亞群的比較  在SEB活化的耐受性效應(yīng)細(xì)胞中, 明顯增殖的細(xì)胞是CD4+ NK1.1+、 CD8+ NK1.1+ 和TcRV8+ NK1.1+ 的NKT細(xì)胞亞群, 它們分別由原始的0.86%、 1.72%和0.92 %上升至9.53%、 7.02%和3.34%(P<0.05, P<0.01, n=4); CD4-CD8-CD3+ NK1.1+NKT細(xì)胞沒(méi)有顯著性增加。相反ConA活化了CD4-CD8-CD3+ N

17、K1.1+NKT細(xì)胞, 使這群細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)由原始的1.51%上升至2.81%（P<0.05, n=4）, 但不能誘導(dǎo)其他NKT細(xì)胞亞群活化增殖（表2）。表2  SEB或ConA活化的T細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)    25  SEB活化的NKT細(xì)胞亞群的分化途徑  圖3、 4的結(jié)果顯示了NKT細(xì)胞亞群的生成途徑。SEB活化的CD4+ NK1.1+、 CD8+ NK1.1+和TcRV8+ NK1.1+ 的NKT細(xì)胞均由T細(xì)胞分化而來(lái)。SEB和ConA 誘導(dǎo)的CD4-CD8-/CD3+ NK1.1+ NKT細(xì)胞亞群主要由NK細(xì)胞分化而來(lái)（圖5）

18、。1             3  討論    NKT細(xì)胞是獨(dú)立的細(xì)胞群, 最初把它定義為T、 B和NK 細(xì)胞之后的第4類的淋巴細(xì)胞。最近的研究報(bào)道了NKT細(xì)胞有可能是T細(xì)胞亞群而不是淋巴細(xì)胞亞群7, 它們可以被糖脂類抗原GalCer活化而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)有學(xué)者報(bào)告了一些內(nèi)源性細(xì)菌產(chǎn)生的糖脂質(zhì)也能活化NKT細(xì)胞8, 9。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)多肽類超抗原SEB能誘導(dǎo)小鼠外周淋巴細(xì)胞大量增殖, 但是增殖后的淋巴細(xì)胞功能與ConA活化的淋巴細(xì)胞完

19、全不同。把SEB活化早期的淋巴細(xì)胞再次暴露于ConA、 LPS和IL2, 其二次應(yīng)答反應(yīng)完全消失; 而ConA活化的淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的二次應(yīng)答反應(yīng)能力依然存在。為了闡明SEB活化的耐受性機(jī)制以及參與耐受調(diào)節(jié)的NKT細(xì)胞亞群, 本研究獲得了SEB體外擴(kuò)增的效應(yīng)細(xì)胞。經(jīng) ConA、 LPS及IL2刺激后這些效應(yīng)細(xì)胞顯示出對(duì)刺激劑的應(yīng)答反應(yīng)明顯降低; 當(dāng)正常淋巴細(xì)胞用上述3種刺激劑活化的同時(shí)添加效應(yīng)細(xì)胞, 淋巴細(xì)胞對(duì)刺激劑的應(yīng)答反應(yīng)受到抑制, 細(xì)胞增殖的A值顯著降低。SEB活化的效應(yīng)細(xì)胞之所以具有很強(qiáng)的耐受功能在于它們不僅降低了T、 B細(xì)胞對(duì)ConA和LPS的應(yīng)答反應(yīng)能力, 還有效地抑制了正常淋巴細(xì)胞

20、對(duì)刺激劑的應(yīng)答反應(yīng)能力。強(qiáng)烈地抑制ConA活化的T淋巴細(xì)胞的增殖, 表明效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用帶有一定的特異性。用流式細(xì)胞術(shù)解析了這些具有耐受功能的效應(yīng)細(xì)胞中T細(xì)胞和NKT細(xì)胞亞群。發(fā)現(xiàn)與ConA活化的T細(xì)胞相比, SEB活化的細(xì)胞主要是NKT細(xì)胞。這些NKT細(xì)胞亞群包括CD4+NK1.1+、 CD8+NK1.1+和TcRV8+/NK1.1+的NKT亞群細(xì)胞;  CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT細(xì)胞亞群無(wú)顯著性增加。相反, 盡管ConA是經(jīng)典的可以選擇性刺激T細(xì)胞增殖的絲裂原, 由ConA活化的淋巴細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞而不是NKT細(xì)胞, 但也表現(xiàn)出CD4-CD8-NKT細(xì)胞的增加

21、（P<0.05）。與具有耐受功能的效應(yīng)細(xì)胞相比, ConA和SEB 誘導(dǎo)生成的 CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT細(xì)胞主要來(lái)自NK細(xì)胞; 而SEB活化的耐受性效應(yīng)細(xì)胞中的NKT細(xì)胞均來(lái)自T細(xì)胞。這些結(jié)果暗示出參與耐受性調(diào)節(jié)的效應(yīng)細(xì)胞主要是CD4+NK1.1+、 CD8+NK1.1+、 TcRV8+/NK1.1+NKT細(xì)胞亞群, 它們由T細(xì)胞分化而來(lái)。由NK細(xì)胞分化而來(lái)的CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT細(xì)胞不參與耐受性調(diào)節(jié)。    致謝:  感謝解放軍總基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)儀器中心王珊技師在流式細(xì)胞測(cè)定方面給予的熱情幫助; 感謝實(shí)

22、驗(yàn)動(dòng)物中心給予的協(xié)助?！尽?#160; 1 Van Kaer L. Regulation of immune responses by CD1drestricted natural killer T cellsJ. Immunol Res, 2004, 30（2）: 139-153.2 Beaudoin L, Laloux V, Novak J, et al. NKT cells inhibit the onset of diabetes by impairing the Development of pathogenic T cells specific for pancreatic cel

23、lsJ. Immunity, 2002, 17(6): 725-736.3 Joyee AG, Qiu H, Wang S, et al. Distinct NKT cell subsets are induced by different chlamydia species leading to differential adaptive immunity and host resistance to the infectionsJ. J Immnol, 2007, 178(2): 1048-1058.4 Seino K, Taniguchi M. Functionally distinct NKT cell subsets and subtypesJ. J Exp Med, 2005, 202(12