超抗原SEB活化耐受性NKT細胞亞群的研究

1、超抗原SEB活化耐受性NKT細胞亞群的研究                       作者：陳鈺, 鐘江 徐健, 陳中才, 郭業(yè)磊, 金婷, 張繼慧 【摘要】  目的: 探討超抗原SEB活化的效應細胞參與免疫耐受的NKT細胞亞群及分化特征。方法: 采用C57BL/J小鼠脾細胞經(jīng)SEB誘導, 收集體外擴增10 d的淋巴細胞為效應細胞, 與刀豆蛋白（ConA）

2、、 脂多糖（LPS）和白介素2（IL2）共同培養(yǎng)3 d, 測定效應細胞對刺激劑的應答反應能力。在正常小鼠淋巴細胞與上述刺激劑反應的同時添加效應細胞, 3 d后測定效應細胞抑制正常淋巴細胞對刺激原的應答反應能力。用MTT染色方法記錄細胞增殖的A值。以ConA活化的淋巴細胞做參照, 用流式細胞術(FCM)解析了耐受性效應細胞中NKT細胞亞群并顯示分化來源與功能的相關性。結果: 與正常淋巴細胞對抗原應答反應能力相比, SEB活化的效應細胞對ConA、 LPS和IL2的應答反應能力明顯降低, 細胞生長的A值從正常組的0.80±0.04、 0.60±0.03和0.55±0.

3、07下降到0.60±0.05、 0.30±0.05及0.27±0.04 (P<0.01, n=3)。效應細胞抑制正常淋巴細胞對上述抗原的應答反應, 尤其抑制ConA 活化的T淋巴細胞的應答反應; A值分別由正常值降低到0.26±0.002、 0.48±0.04及0.34±0.02(P<0.01, n=3)。效應細胞中CD4+NK1.1+、 CD8+NK1.1+、 TcRV8+/NK1.1+NKT細胞亞群顯著增加(P<0.05和P<0.01, n=4)。ConA活化的淋巴細胞是T淋巴細胞并包括CD4-CD8-/C

4、D3+ NK1.1+ NKT細胞。結論: 超抗原SEB活化的耐受功能與CD4+NK1.1+、 CD8+NK1.1+、 TcRV8+NK1.1+NKT細胞亞群有關, 它們由T細胞分化而來。 CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT細胞沒有參與耐受性調(diào)節(jié)。 【關鍵詞】  NKT細胞亞群; 超抗原; SEB; 免疫耐受    NKT細胞是以NK細胞和T細胞兩者為特征的, 僅占淋巴細胞群的1%1。NKT細胞的作用主要有兩個方面, 效應功能和調(diào)節(jié)功能。它可以抑制Th1細胞的過激, 控制IL2, IFN的產(chǎn)生和后期的細胞增殖, 可以調(diào)節(jié)Th2細胞的細胞因子產(chǎn)生,

5、 使T細胞分化朝Th2方向偏移; 它也可以在Th1細胞抵抗感染和腫瘤時提供幫助以及可以阻止部分細胞的分化, 控制自身免疫病的發(fā)生和2。越來越多的研究報道了NKT細胞有很多亞群3, 4, 但是仍不能區(qū)別不同亞群的不同功能以及它們的來源和分化途徑。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B（Staphylococcal enterotoxin B,  SEB）能誘導外周淋巴細胞生成效應細胞, 這些效應細胞具有明顯的抗排斥作用和免疫耐受特征, 并且均伴隨NKT細胞的增加5, 6。本研究用超抗原SEB在體外擴增了具有耐受功能的效應細胞, 對這些細胞的耐受調(diào)節(jié)特征、 細胞亞群以及在外周淋巴

6、系統(tǒng)生成的NKT細胞的分化途徑進行了研究。    1  材料和方法    1.1  材料  C57BL/J小鼠（雌性, 質量1820 g,  68周齡）來自解放軍第301實驗動物中心二級動物房。RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司, MTT染料（四甲基偶氮唑鹽3（4.5dimethyiazolzyl）2.5diphenyl tetrazolium bromide）、 ConA和LPS均購自Sigma公司, 二甲基亞砜(DMSO)購自Solarbio 公司, 胎牛血清購自北京軍區(qū)獸醫(yī)防治中心,

7、 IL2由解放軍302醫(yī)院病毒研究所惠贈; SEB（自主知識產(chǎn)權, 專利號: 00103991.4）; 抗CD3PerCP、 CD4FITC、 CD8PE、 NK1.1APC和抗TcRV8PE熒光抗體均購自BD公司。    12  方法    121  正常小鼠淋巴細胞制備  摘取C57BL/J小鼠脾細胞在無菌臺前分離細胞, 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液, 經(jīng)紅細胞裂解, 洗滌2次后, 制備成密度為5×109/L個細胞的懸浮液待用。  &#

8、160; 122  SEB活化的耐受性效應細胞制備  在25 mL培養(yǎng)瓶中加入1×109細胞/L, 隨后加入3.5 mL 400 g/L SEB混合后置37、  50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)5 d。洗滌換液后細胞繼續(xù)培養(yǎng)到第10天, 收獲細胞, 作為耐受細胞懸浮至5×109細胞/L用于抑制功能實驗。    123  SEB活化的耐受性效應細胞對刺激劑的應答反應  在96孔板中加入5×105細胞/(100 L/孔), 并分別加入0.1 mL ConA(10 mg/L),  0

9、.1 mL LPS(10 mg/L)和0.1 mL IL2（200 IU/mL）, 對照組加入培養(yǎng)液。在37、  50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)3 d后MTT染色, 570 nm波長下測定細胞增殖的A值。    124  SEB活化的耐受性效應細胞抑制功能的測定  在96孔板中加入正常C57BL/J小鼠脾細胞5×105細胞/（100 L/孔）, 并在分別加入0.1 mL ConA(10 mg/L),  0.1 mL LPS(10 mg/L)和0.1 mL IL2（200 IU/mL）的同時加入SEB活化的效應細胞5

10、×105細胞/（100 L/孔）。對照組為正常淋巴細胞分別加入上述相應刺激原。在37、  50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)3 d后MTT染色, 570 nm波長下測定細胞增殖的A值。    125  SEB活化耐受性效應細胞的T細胞和NKT細胞亞群解析  實驗分為SEB和ConA兩個組。在96孔板中加入5×105細胞/（100 L/孔）, 并分別加入0.1 mL SEB(400 g/L)和0.1 mL ConA(10 mg/L),  在37、 50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。取培養(yǎng)第10天的細胞經(jīng)抗CD3

11、PerCP、 CD4FITC、 CD8PE和NK1.1APC以及CD3PerCP、 CD4FITC、 NK1.1APC和TcRV8PE熒光抗體四染色后, 用流式細胞儀（FACs Calibue BD,  USA）測定T細胞、 NKT細胞亞群增殖的百分數(shù)并記錄NKT細胞亞群分化途徑。    126  統(tǒng)計學分析  計量資料用x±s表示。采用t檢驗分析。所有數(shù)據(jù)均用CHISS統(tǒng)計軟件處理。    2  結果    21  SEB活化的耐受性效應細胞對

12、刺激劑的應答反應性下降  用ConA、 LPS、 IL2分別刺激正常淋巴細胞或SEB活化效應的細胞, 3 d之后MTT方法檢測細胞增殖并記錄增殖的A值。SEB活化的效應細胞對ConA、 LPS和IL2的應答反應能力由正常的0.80±0.04,  0.60±0.03和0.55±0.07下降到0.60±0.05,  0.30±0.05及0.27±0.04 (P<0.01,  n=3,  圖1)。    圖1  SEB 活化的效應細胞對刺激劑的應

13、答反應    Fig 1  The response of the effecter cells by SEBactivated to several mitogens    eff.cells:  The effector cells by SEBactivated.  bP<0.01 vs control group.    22  SEB活化的耐受性效應細胞抑制正常淋巴細胞對刺激劑的應答反應  正常淋巴細胞在分別加入ConA、 LPS、 IL2

14、的同時加入SEB活化的效應細胞, 經(jīng)培養(yǎng)后, 正常淋巴細胞與刺激原的應答反應能力明顯受到抑制, 尤其抑制正常細胞與ConA的應答反應能力。細胞的增殖能力由正常值由正常A值0.80±0.04、  0.60±0.03和0.55±0.07下降到0.26±0.002、  0.48±0.04及0.34±0.02(P<0.01,  n=3,  圖2)。    23  SEB或ConA活化T淋巴細胞亞群的比較  在SEB活化的具有耐受功能的效應細胞中CD

15、3+、 CD4+ T細胞亞群百分數(shù)分別由原始的27.52%和15.04%下降至18.74%和12.35%(P<0.01, n=4), CD8+T細胞百分數(shù)略有增加, 由原始的16.11%上升到23.18%（P>0.05）, TcRV8+T細胞從10.55%上升到28.48%（P<0.01, n=4）。ConA活化的淋巴細胞主要是T淋巴細胞, 包括CD3+、 CD4+、 CD8+和TcRV 8+T細胞亞群。它們分別由最初的27.52%、 15.04%、 16.11%和10.55%上升到41.72%、 36.49%、 54.21%及25.86%（P<0.01, 

16、n=4, 表1)。表1  SEB或ConA活化的T細胞亞群百分數(shù)    24  SEB和ConA活化的NKT細胞亞群的比較  在SEB活化的耐受性效應細胞中, 明顯增殖的細胞是CD4+ NK1.1+、 CD8+ NK1.1+ 和TcRV8+ NK1.1+ 的NKT細胞亞群, 它們分別由原始的0.86%、 1.72%和0.92 %上升至9.53%、 7.02%和3.34%(P<0.05, P<0.01, n=4); CD4-CD8-CD3+ NK1.1+NKT細胞沒有顯著性增加。相反ConA活化了CD4-CD8-CD3+ N

17、K1.1+NKT細胞, 使這群細胞的百分數(shù)由原始的1.51%上升至2.81%（P<0.05, n=4）, 但不能誘導其他NKT細胞亞群活化增殖（表2）。表2  SEB或ConA活化的T細胞亞群百分數(shù)    25  SEB活化的NKT細胞亞群的分化途徑  圖3、 4的結果顯示了NKT細胞亞群的生成途徑。SEB活化的CD4+ NK1.1+、 CD8+ NK1.1+和TcRV8+ NK1.1+ 的NKT細胞均由T細胞分化而來。SEB和ConA 誘導的CD4-CD8-/CD3+ NK1.1+ NKT細胞亞群主要由NK細胞分化而來（圖5）

18、。1             3  討論    NKT細胞是獨立的細胞群, 最初把它定義為T、 B和NK 細胞之后的第4類的淋巴細胞。最近的研究報道了NKT細胞有可能是T細胞亞群而不是淋巴細胞亞群7, 它們可以被糖脂類抗原GalCer活化而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。近年來有學者報告了一些內(nèi)源性細菌產(chǎn)生的糖脂質也能活化NKT細胞8, 9。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)多肽類超抗原SEB能誘導小鼠外周淋巴細胞大量增殖, 但是增殖后的淋巴細胞功能與ConA活化的淋巴細胞完

19、全不同。把SEB活化早期的淋巴細胞再次暴露于ConA、 LPS和IL2, 其二次應答反應完全消失; 而ConA活化的淋巴細胞對抗原的二次應答反應能力依然存在。為了闡明SEB活化的耐受性機制以及參與耐受調(diào)節(jié)的NKT細胞亞群, 本研究獲得了SEB體外擴增的效應細胞。經(jīng) ConA、 LPS及IL2刺激后這些效應細胞顯示出對刺激劑的應答反應明顯降低; 當正常淋巴細胞用上述3種刺激劑活化的同時添加效應細胞, 淋巴細胞對刺激劑的應答反應受到抑制, 細胞增殖的A值顯著降低。SEB活化的效應細胞之所以具有很強的耐受功能在于它們不僅降低了T、 B細胞對ConA和LPS的應答反應能力, 還有效地抑制了正常淋巴細胞

20、對刺激劑的應答反應能力。強烈地抑制ConA活化的T淋巴細胞的增殖, 表明效應細胞的抑制作用帶有一定的特異性。用流式細胞術解析了這些具有耐受功能的效應細胞中T細胞和NKT細胞亞群。發(fā)現(xiàn)與ConA活化的T細胞相比, SEB活化的細胞主要是NKT細胞。這些NKT細胞亞群包括CD4+NK1.1+、 CD8+NK1.1+和TcRV8+/NK1.1+的NKT亞群細胞;  CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT細胞亞群無顯著性增加。相反, 盡管ConA是經(jīng)典的可以選擇性刺激T細胞增殖的絲裂原, 由ConA活化的淋巴細胞是T淋巴細胞而不是NKT細胞, 但也表現(xiàn)出CD4-CD8-NKT細胞的增加

21、（P<0.05）。與具有耐受功能的效應細胞相比, ConA和SEB 誘導生成的 CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT細胞主要來自NK細胞; 而SEB活化的耐受性效應細胞中的NKT細胞均來自T細胞。這些結果暗示出參與耐受性調(diào)節(jié)的效應細胞主要是CD4+NK1.1+、 CD8+NK1.1+、 TcRV8+/NK1.1+NKT細胞亞群, 它們由T細胞分化而來。由NK細胞分化而來的CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT細胞不參與耐受性調(diào)節(jié)。    致謝:  感謝解放軍總基礎醫(yī)學研究所實驗儀器中心王珊技師在流式細胞測定方面給予的熱情幫助; 感謝實

22、驗動物中心給予的協(xié)助?！尽?#160; 1 Van Kaer L. Regulation of immune responses by CD1drestricted natural killer T cellsJ. Immunol Res, 2004, 30（2）: 139-153.2 Beaudoin L, Laloux V, Novak J, et al. NKT cells inhibit the onset of diabetes by impairing the Development of pathogenic T cells specific for pancreatic cel

23、lsJ. Immunity, 2002, 17(6): 725-736.3 Joyee AG, Qiu H, Wang S, et al. Distinct NKT cell subsets are induced by different chlamydia species leading to differential adaptive immunity and host resistance to the infectionsJ. J Immnol, 2007, 178(2): 1048-1058.4 Seino K, Taniguchi M. Functionally distinct NKT cell subsets and subtypesJ. J Exp Med, 2005, 202(12