毛葡萄葉水提物對(duì)血栓形成和血黏度的影響

1、毛葡萄葉水提物對(duì)血栓形成和血黏度的影響                   作者：荊春霞，周芃，楊亞安，王旻晨，王曉春，吳開(kāi)云【摘要】  目的探討毛葡萄葉水提物對(duì)血栓形成和血黏度影響并研究其主要作用機(jī)理。方法用大鼠動(dòng)靜脈旁路血栓形成模型觀察血栓的形成 ,測(cè)定血栓濕重及干重；放射免疫法測(cè)定TXB2和6-keto-PGF1水平；用血瘀血液流變學(xué)模型測(cè)定全血黏度。結(jié)果毛葡萄葉水提物可劑量依賴(lài)性抑制大鼠血栓形成,其

2、血栓干重及濕重與對(duì)照組相比均顯著降低(P<0.05或P<0.01 )，有降低血漿TXB2和升高6-keto-PGF1水平，對(duì)血液黏度也有明顯降低作用。結(jié)論毛葡萄葉水提物有明顯抗血栓形成和降低血黏度作用，其機(jī)制可能與影響血漿TXB2和6-keto-PGF1含量水平有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  毛葡萄葉水提物; 血栓; 模型; 大鼠; 血栓素B2; 前列環(huán)素; 血粘度          臨床上由血栓引起的心、腦血管病發(fā)病率逐年增加，尋找有效的抗血栓藥是這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近來(lái)研究表明從中草藥中尋

3、找具有抗血栓作用的藥物具有良好的前景。毛葡萄Vitis quinquangularis Rehd，為木質(zhì)藤本植物，味酸、微苦，性平,根皮和葉可作藥用，有調(diào)經(jīng)活血、舒筋活絡(luò)作用，外用治跌打損傷、筋骨疼痛，外傷出血等1?，F(xiàn)有的資料中并未發(fā)現(xiàn)毛葡萄及其提取物具有抗血栓的作用，本實(shí)驗(yàn)采用被廣泛用于抗血栓藥物的研究動(dòng)靜脈旁路模型和急性血瘀血流變學(xué)模型2，3，首次發(fā)現(xiàn)毛葡萄葉水提物有明顯抗血栓形成和降低全血血黏度的作用（已申請(qǐng)發(fā)明專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)枺?00810025205.X），并對(duì)其主要作用機(jī)制進(jìn)行了探討。現(xiàn)報(bào)道如下。1  材料與儀器1.1  動(dòng)物SD大鼠,各半， 體質(zhì)量(250

4、7;20)g，蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)，SPF級(jí),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):XCYK(蘇)2002-0008,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(蘇)2002-0037。1.2 儀器 精密天平（上海奧豪斯公司）；DK-600型電熱恒溫水槽；TDL80-2B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭儀器制造廠）；LEICARM2126RT石蠟切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；OLYMPUS CX31顯微鏡（日本OLYMPUS公司） ；TYXN-96多功能智能血液凝聚儀 ；放免計(jì)數(shù)儀 FJ-2003/50A。1.3  藥品及試劑毛葡萄葉水提物制備：取500 g干毛葡萄葉（來(lái)源：江西，蘇州大學(xué)生藥研究所鑒定）

5、，浸泡于水中，加熱提取3次，45 min/次，合并提取液用蒸發(fā)濃縮至1 000 ml，再用終濃度為50%乙醇沉去雜質(zhì)，過(guò)濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，濃縮后的溶液經(jīng)冷凍干燥后得到粉末狀提取物150 g（批號(hào)為：KXSH-T1），主要成分為黃酮（25% ），還含有酚類(lèi)、氨基酸等。實(shí)驗(yàn)時(shí)配成30%(約含生藥1g·ml-1)；血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)和6-酮-前列腺素F1(6-keto-prostaglandinF1, 6-keto-PGF1)放射免疫測(cè)定試劑盒購(gòu)自蘇州大學(xué)江蘇省血液學(xué)研究所，復(fù)方丹參滴丸(compound dan shen dripping pill

6、s, CDDP ),天津天士力制藥股份有限公司產(chǎn)品，規(guī)格為每粒27mg，批號(hào)：20060802，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z10950111。 鹽酸腎上腺素注射液 1mg/ml上海禾豐制藥有限公司  批號(hào) 070902,其它試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。2 方法2.1 動(dòng)靜脈旁路血栓模型與給藥分組SD大鼠50只，各半， 體質(zhì)量(250±20)g，分為對(duì)照組，中藥(VRE)大、中、小劑量組和丹參(CDDP)組各10只，各組動(dòng)物分養(yǎng)。大劑量中藥組每天灌中藥4 ml（4g·kg-1）；中劑量中藥組每天灌中藥4 ml（2g·kg-1）；小劑量中藥組每天灌中藥4 ml（1 g&

7、#183;kg-1）；對(duì)照組灌生理鹽水4 ml每只；丹參組（70 mg· kg-1）。連續(xù)灌胃9 d；第10天于灌胃1 h后按血栓模型過(guò)程行動(dòng)靜脈旁路術(shù)。2.2  動(dòng)靜脈旁路模型的建立3.6%水合氯醛1ml·100 g-1麻醉后固定于解剖臺(tái)上，準(zhǔn)備好一根塑料管（d=0.3 mm）兩端拉細(xì)，管中放置一根6 cm的4號(hào)線，并灌滿(mǎn)50 U·ml-1肝素。分離右側(cè)的頸總動(dòng)脈和左側(cè)的頸外靜脈。靜脈端先結(jié)扎靜脈遠(yuǎn)心端，剪開(kāi)一個(gè)小口，將管向近心端插入并結(jié)扎固定。動(dòng)脈端先用血管夾夾住近心端，剪開(kāi)一個(gè)小口，將管向近心端插入并結(jié)扎固定。然后放開(kāi)血管夾，保證血流通暢，計(jì)時(shí)20

8、 min后將線取出2。分別稱(chēng)量栓線的濕重和干重，將形成的血栓固定、包埋，切片、HE染色，觀察血栓成分。并腹主動(dòng)脈取血，離心2 000 r/min，取血清，-20保存待測(cè)TXB2和6-keto-PGF1含量。2.3  血栓重量測(cè)定取下栓線后在濾紙上吸干后,用電子分析天平測(cè)定其重量。然后置60 烘箱烘干至恒重稱(chēng)其重量為干重。1         2.4  血栓形態(tài)學(xué)觀察各組取血栓形成栓線作石蠟切片,HE染色后光鏡下觀察血栓。2.5  血栓素B2(TXB2)、6-keto-PGF1檢測(cè)用放射免

9、疫法測(cè)定血清中的TXB2和6-keto-PGF1的含量并出TXB2與6-keto-PGF1比值。2.6  血淤血流變學(xué)模型與給藥分組SD大鼠40只，大鼠,各半， 體質(zhì)量(250±20) g，將大鼠分為4組，每組10只，即對(duì)照組、血瘀模型組、丹參組、中藥模型組，各組動(dòng)物分養(yǎng)。對(duì)照組：每天生理鹽水灌胃5 ml/只，連續(xù)7 d。第7天停食，次晨取血檢測(cè)。 造模組: 每日丹參組(70 mg·kg-1)，中藥中劑量組(2 g·kg-1) 灌胃，分灌不同藥物連續(xù)7d，于第7天皮下注射腎上腺素0.08 ml·100 g-1，共2次，2次相隔4 h，于第1次注

10、射后2 h，將大鼠浸入冰水中5 min，處置后停食，次晨取血檢測(cè)4，5。2.7  全血血粘度的檢測(cè) 腹主動(dòng)脈抽血5 ml，EDTA-2Na抗凝，TYXN-96多功能智能血液凝聚儀測(cè)定全血高切，中切，低切血粘度。2.8  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)用±s表示，顯著性檢驗(yàn)采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行one-way ANOVA分析并以t檢驗(yàn)，組間差異以<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。3結(jié)果3. 1  對(duì)血栓形成的影響血栓HE染色顯示，對(duì)照組線栓形成的血栓,血栓體是以血小板、紅細(xì)胞和少量白細(xì)胞的混合型血栓，其中血小板形成的結(jié)構(gòu)最明顯（見(jiàn)圖 1a

11、）；給藥組中的大、中、小劑量組血栓形成明顯小于對(duì)照組，并且血栓體較疏松,血栓體中血小板形成的結(jié)構(gòu)明顯小于對(duì)照組（見(jiàn)圖1bd）。丹參組與對(duì)照組對(duì)比，血栓有不同程度的減小，但與藥物組比較，其血栓明顯大于藥物組。血栓重量測(cè)定結(jié)果也與形態(tài)學(xué)觀察一致。藥物組有明顯降低血栓重量(P<0.05,P<0.01 ,P<0.01），見(jiàn)表1，其中中藥中劑量組作用最顯著。表1  各組大鼠血栓形成重量比較（略）3.2  對(duì)TXB2和6-keto-PGF1水平的影響對(duì)照組血漿TXB2含量升高(P<0.01),而6-keto-PGF1含量降低(P<0.01)，TXB2/6-

12、keto-PGF1數(shù)值增大（P<0.01）。與對(duì)照組比較，毛葡萄小、中、大劑量組能明顯降低血漿TXB2含量(P<0.05，P<0.01) ,而升高6-keto-PGF1含量(P<0.05，P<0.01)，TXB2/6-keto-PGF1數(shù)值降低有顯著性差異（均P<0.01）。丹參組與毛葡萄中、高劑量組的作用相似（P<0.05、P<0.01）。見(jiàn)表2。表2  TXB2和6-keto-PGF1含量測(cè)定結(jié)果（略）3.3  對(duì)全血血粘度的影響模型組，中劑量組與丹參組血粘度高切，中切，低切都明顯高于對(duì)照組。但中劑量組與丹參組都降低了3種

13、切變率狀態(tài)下的血粘度（P<0.01，P<0.05）。見(jiàn)表3。表3  各組血粘度檢測(cè)結(jié)果（略）4討論    血栓形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，血小板在血栓形成過(guò)程中是一重要因子。當(dāng)血管受損傷時(shí),血小板在病變部位蓄積 ,導(dǎo)致血栓形成閉塞血管,引起缺血性組織損傷。血栓形成是許多心腦血管疾病的主要發(fā)病原因。阻止血栓形成是預(yù)防心腦血管疾病的關(guān)鍵5。本文采用動(dòng)靜脈旁路模型觀察了毛葡萄葉水提物3種劑量（1，2，4 g·kg-1）對(duì)血栓形成的影響及作用機(jī)制。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出中藥（大、中、小劑量）組都有明顯抗血栓形成作用，給藥組的血栓干、濕重與對(duì)照組相比明

14、顯減小。血栓的HE染色也可以看出各組均是混合型血栓（紅細(xì)胞、血小板和白細(xì)胞組成），但對(duì)照組血栓體是以血小板形成的結(jié)構(gòu)最明顯，給藥大、中、小劑量組血栓形成明顯小于模型組且栓體較疏松,血栓體中血小板形成的結(jié)構(gòu)明顯小于對(duì)照組，特別中劑量藥物組血小板形成的結(jié)構(gòu)明顯減少。    血栓素A2(TXA2)主要在血小板生成，能引起微血管收縮、血小板凝聚、血栓形成和止血。而前列環(huán)素(PGI2)主要在血管壁生成，作用與TXA2相反呈強(qiáng)力擴(kuò)張微血管，抗血小板凝聚，防止血栓形成，正常生理狀態(tài)下,完整無(wú)損的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有抑制血小板在其表面粘附聚集和活化、抗血栓功能,在循環(huán)血液中TXA2

15、和PGI2 的濃度處于相對(duì)平衡狀態(tài),二者在體內(nèi)形成一種精巧的分子調(diào)節(jié)機(jī)制,對(duì)血管舒縮,血小板聚集及血栓形成起著重要的調(diào)節(jié)作用。由于二者的極不穩(wěn)定，TXA2半衰期為30 s, PGI2的半衰期也僅有3 min，所以二者分泌后便迅速穩(wěn)定代謝為T(mén)XB2 和6-Keto-PGF1a 6，因此通常通過(guò)測(cè)定TXB2和6-Keto-PGF1a 的變化來(lái)反映TXA2和PGI2的變化情況，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明毛葡萄小、中、大劑量組能明顯降低血漿TXB2含量,而升高6-keto-PGF1含量，其中中劑量效果最好；與陽(yáng)性藥物丹參組對(duì)照其與中劑量組也好于丹參組。說(shuō)明毛葡萄葉提取液的抗血栓作用與TXB2和6-keto-PG

16、F1水平相關(guān)。    中醫(yī)理論認(rèn)為心腦血管疾病是“暴怒”所致肝陽(yáng)上亢，突遇外寒之邪侵襲可引發(fā)寒凝氣滯，致使血行不暢、脈絡(luò)不通最終造成血淤3，6，7。醫(yī)學(xué)認(rèn)為血黏度反映的是血液在流動(dòng)時(shí)內(nèi)摩擦力的大小，內(nèi)摩擦力越大，血液的淤度就越大，它在血管中流動(dòng)的阻力就越大，血液流動(dòng)的速度也就越慢，最終導(dǎo)致組織缺血缺氧，如血管受損更易形成血栓8，9。許多研究證明血淤度增高是由于紅細(xì)胞的變形能力、剛性及紅細(xì)胞的聚集能力的改變，影響微循環(huán)及組織、器官的血流量，以導(dǎo)致疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)在急性血淤模型上證明毛葡萄葉水提物對(duì)血黏度有明顯改善作用，給藥組血黏度高切，中切，低切都明顯低于對(duì)照模型

17、組和丹參組。該模型具有血液流變性指標(biāo)變化穩(wěn)定，重復(fù)性好，對(duì)活血化淤中藥的反應(yīng)敏感等優(yōu)點(diǎn)4，10。    本實(shí)驗(yàn)首次觀察了毛葡萄葉提取物對(duì)血栓形成的影響，并初步證此藥對(duì)血栓形成和降低血黏度有較好作用。毛葡萄來(lái)源廣泛，其提取工藝簡(jiǎn)單，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床上尋找良好的抗血栓藥打下了一個(gè)較好基礎(chǔ)。 【】  1全國(guó)中草藥匯編編寫(xiě)組.全國(guó)中草藥匯編（下冊(cè)），第2版M.北京:人民衛(wèi)生出版社，1996:145.2徐叔云,卞如濂,陳 修,等. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)M. 北京:人民衛(wèi)生出社,1991：1124.3張愛(ài)林，孫建寧，徐秋萍，等. 復(fù)方銀杏滴丸

18、對(duì)急性血瘀模型大鼠的保護(hù)作用J.藥通報(bào)，2003 ，19(10)：1989.4楊詩(shī)杰，蘇汝好，項(xiàng)嵐，等消栓降脂丸對(duì)急性血瘀模型大鼠血液流變學(xué)影響的對(duì)照研究J時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(10)：1880.5Eitzman DT, Westrick RJ , Xu Z， et al. Hyperlip idmiap romotes thrombosis after injury to atherosclerotic vessels in apolipop rotein E - deficient miceJ.ArteriosclerThromb Vasc Biol, 2000, 20 (7) : 1831.6梁知，頊志兵，顧仁樾. 血