雙向電泳所需試劑

1、GE Healthcare Life Sciences用戶需要準備事項1. 確定電源接地2. 單蒸水3. 操作環(huán)境：1530 °C ±2 °C4. 操作環(huán)境濕度要求：相對濕度070%*5. 大量筒或燒杯 ( 1L, 500ml,250ml,50ml)6. 去離子水或MilliqQ水7. 提前購買染膠的盒子（30×20cm，最好有蓋子）如需實驗：準備樣品和如下試劑。附錄 I 溶液注意請按照實驗所需量酌量或減量配制A. 雙向電泳的樣品裂解溶液(含有尿素) （8 M尿素，4% CHAPS，2%兩性載體Pharmalyte或IPG緩沖液(載體兩性電解質(zhì))，40

2、mM DTT, 25 ml）最終濃度用量尿素(FW 60.06) 8 M 12 g CHAPS 4% (w/v) 1.0 g 兩性載體Pharmalyte 或IPG緩沖液(現(xiàn)用現(xiàn)加) 2% (v/v) 500 µl DTT (FW 154.2) 40 mM 154 mg 雙蒸水 至25 ml (需要水約16ml) 分裝為 1.0 ml溶液儲存于-20條件下。IPG buffer和DTT現(xiàn)用現(xiàn)加。酌情增減使用量,每個樣品使用約1ml. (本次培訓需要5ml)B. 尿素水化儲備溶液 （8 M尿素，2% CHAPS，0.5/2%兩性載體Pharmalyte或IPG緩沖液，0.002%溴酚藍

3、, 25 ml）*最終濃度用量尿素(FW 60.06) 8M12gCHAPS 2%(w/v)0.5g兩性載體Pharmalyte或 IPG緩沖液(與IPG膠條的范圍相同)(現(xiàn)用現(xiàn)加)0.5%(v/v) 125µl1%溴酚藍儲備溶液0.002%50µl雙蒸水 至25ml(需要水約16ml)分裝為1.0ml溶液儲存于-20 條件下。每個樣品使用約1ml. (本次培訓需要5ml)使用前加入DTT和IPG buffer，每1.0ml水化儲備溶液中加入2.8mgDTT。載體兩性電解質(zhì)或IPG緩沖液現(xiàn)用現(xiàn)加。 C. SDS平衡緩沖液(6 M尿素，75 mM Tris-HCl pH8.8

4、,29.3%甘油, 2%SDS,0.002%溴酚藍,200ml)*最終濃度用量尿素(FW 60.06) 6 M 72.1 g Tris-HCl, pH 8.8 (參見溶液F部分) 75 mM 10.0 ml 甘油(87% w/w) 29.3% (v/v) 69 ml (84.2 g) SDS (FW 288.38) 2% (w/v) 4.0 g 1%溴酚藍儲備溶液0.002% (w/v) 400 µl 雙蒸水 至200 ml 這是儲備溶液。在使用之前，按照一定量加入1%DTT（100mg/10ml）或2.5%碘乙酰胺（250mg/10ml），分別用于第一次和第二次平衡。Max用量 1

5、0ml/膠條。分裝為20或50ml溶液儲存于-20條件下。 （本次培訓需要100ml） D. 10× Laemmli SDS電泳緩沖液(250 mM Tris堿，1.92M甘氨酸，1% SDS，10L)* 最終濃度用量 Tris堿(FW 121.1) 250 mM 303 g 甘氨酸(FW 75.07) 1.92 M 1441 g SDS (FW 288.38) 1% (w/v) 100 g 雙蒸水 至10L * 不要調(diào)節(jié)該溶液的pH值。室溫條件下儲存。根據(jù)不同型號二向電泳槽，根據(jù)電泳槽規(guī)格每次實驗用量1× Laemmli SDS電泳緩沖液 1-10L。 （本次培訓配制1L

6、，用量分別為Tris 30.3g, 甘氨酸144.1g, SDS 10g,溶解在1L水里）E. 30% T, 2.6% C單體儲液(30%丙烯酰胺，0.8% N, N-甲叉雙丙烯酰胺，500ml)最終濃度用量丙烯酰胺(FW 71.08) 30% 150 g N,N-甲叉雙丙烯酰胺(FW 154.17) 0.8% 4 g 雙蒸水 至500mL用0.45m濾膜過濾溶液，4避光儲存。F. 4×分離膠緩沖液(1.5M Tris堿，pH8.8，500mL)最終濃度用量 Tris堿(FW 121.1) 1.5 M 90.8g 雙蒸水 375 ml HCl 調(diào)至pH8.8 雙蒸水 至500mL 用

7、0.45m濾膜過濾溶液，4存儲。G溴酚藍儲備溶液最終濃度用量 溴酚藍1%100 mg Tris-堿50 mM 60 mg 雙蒸水 至10 mL H. 10% SDS溶液(10% SDS, 50 ml)最終濃度用量 SDS (FW 288.38)10% (w/v)5.0 g雙蒸水 至50 ml 用0.45m濾膜過濾溶液，室溫存儲。I. 10%過硫酸銨溶液 (10%過硫酸銨, 10 ml和1 ml) 最終濃度10 ml的用量 1 ml的用量 過硫酸銨(FW 228.20) 10% (w/v) 1.0 g 0.1 g 雙蒸水 至10 ml 至1 ml 新鮮的過硫酸銨在加入水時發(fā)出“劈啪”聲，若沒有聲

8、音，請更換過硫酸銨。在用前配制。J. 瓊脂糖密封液(25mM Tris堿, 192mM甘氨酸, 0.1% SDS, 0.5%瓊脂糖, 0.002% 溴苯酚藍, 10ml)最終濃度用量Laemmli電泳緩沖液（見溶液D）10 ml 瓊脂糖(NA 或M)0.5% 0.05 g 1%溴酚藍儲備溶液 0.002% (w/v) 20 µl 將所有成分加入到100ml 的燒瓶中。輕輕地搖晃，使成分混勻。加熱直至瓊脂糖完全溶解。不要讓溶液爆沸。以1.5ml為單位分裝至帶有螺旋帽的管內(nèi)，室溫保存。K. 水飽和正丁醇用量n, i, or t-butanol 50 ml50 mlDistilled or deionized water10ml Combine in a bottle and shake,use the top phase to overlay gels. Store at room temperature indefinitely.配12的分離膠，按下表加入各組分。一塊膠需50ml膠液，兩塊膠需90ml膠液。12%SDSPAGE（單位：ml）510152025304050水1.63.34.96.68.29.913.216.530%丙烯酰胺溶液2468101216201.5 mol/L Tris (