內(nèi)酰胺抗生素的抗藥性機(jī)理的淺議

1、內(nèi)酰胺抗生素的抗藥性機(jī)理的淺議        【論文關(guān)鍵詞】青霉素結(jié)合蛋白 金黃色葡萄球菌 綠膿桿菌; 細(xì)菌細(xì)胞壁 病原菌 點(diǎn)結(jié)合 大腸桿菌    【論文摘要】-內(nèi)酰胺抗生素(如青霉素類和頭孢菌素類等)可以專一性與細(xì)菌細(xì)胞膜上的靶位點(diǎn)結(jié)合,干擾細(xì)胞壁肽聚糖合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于靶位點(diǎn)能與同位素標(biāo)記的青霉素G進(jìn)行共價結(jié)合,因此將這些靶位點(diǎn)稱之為青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin binding pro-teins,PBPs)。一些革藍(lán)氏陰性細(xì)菌和少數(shù)革藍(lán)氏陽性菌能夠產(chǎn)生多種-內(nèi)酰胺酶,這些酶可

2、以水解青霉素和頭孢菌素等抗生素,而使細(xì)胞具有抵抗這類-內(nèi)酰胺抗生素的殺傷能力。已經(jīng)證明-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生與質(zhì)粒和染色體基因有關(guān)。對于不產(chǎn)生-內(nèi)酰胺    -內(nèi)酸胺抗生素(如青霉素類和頭抱菌素類等)可以專一性與細(xì)菌細(xì)胞膜上的靶位點(diǎn)結(jié)合,干擾細(xì)胞壁膚聚糖合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于靶位點(diǎn)能與同位素標(biāo)記的青霉素G進(jìn)行共價結(jié)合,因此將這些靶位點(diǎn)稱之為青霉素結(jié)合蛋白(penieillinbindsng pro-teins,PBPs)。一些革藍(lán)氏陰性細(xì)菌和少數(shù)革藍(lán)氏陽性菌能夠產(chǎn)生多種一內(nèi)酞胺酶,這些酶可以水解青霉素和頭抱菌素等抗生素,而使細(xì)胞具有抵抗這類一內(nèi)酞胺抗生素的殺傷能力。已經(jīng)

3、證明一內(nèi)酞胺酶產(chǎn)生與質(zhì)粒和染色體基因有關(guān)。對于不產(chǎn)生莊內(nèi)酞胺酶的細(xì)菌而言,獲得刀一內(nèi)酞胺抗性的能力是通過改變抗生素作用的靶位點(diǎn),其結(jié)果或者減少PBP5的數(shù)量或者降低PBPs對藥物的親和力。這種不依賴刀一內(nèi)酞胺酶而存在的莊內(nèi)酞胺抗性廣泛存在于人類病原菌中,而絕大多數(shù)這類病原菌是從經(jīng)過刀一內(nèi)酞胺藥物治療過的病人中分離出來的,如許多臨床分離到的綠膿桿菌1、金黃色葡萄球菌2-3、流感嗜血桿菌(4-5)、肺炎鏈球菌(6-7)、淋球菌臨(8-9)、屎鏈球菌(10-11)等均具有內(nèi)在的-內(nèi)酚胺抗性。由于臨床上越來越多地分離到月耐藥性細(xì)菌,對于一內(nèi)酞胺抗生素的:使用目困.提出了挑戰(zhàn),有關(guān)細(xì)菌對一內(nèi)酞胺藥物抗性

4、機(jī)理的研究也就越來越多地引起人們的重視,這種研究對發(fā)展新一代抗生素更有效地用于臨床治療具有重要意義。本文主要介紹細(xì)菌內(nèi)在的口一內(nèi)酞胺抗性機(jī)理研究進(jìn)展。    一、PBpS的生物學(xué)特性    早在1940年Gardner在觀察青霉素G對敏感細(xì)菌作用時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁是-內(nèi)酞胺抗生素最初攻擊的靶位點(diǎn),因?yàn)榍嗝顾谿的作用首先是削弱細(xì)胞壁的功能。后來進(jìn)一步證實(shí)莊內(nèi)酸胺抗生素首先與細(xì)胞膜上的PBP產(chǎn)S結(jié)合,這些PBPs具有酶活性,參與細(xì)菌細(xì)胞壁膚聚糖的合成。膚聚糖主要負(fù)責(zé)維持細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性,生長在低滲環(huán)境中的細(xì)菌如該結(jié)構(gòu)破壞會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。一內(nèi)酞

5、胺抗生素與PBPS結(jié)合,干擾了PBPs的正常酶功能,使細(xì)胞壁正常合成阻斷。所有檢測的真細(xì)菌種至少含有3種PBPS,有些含有8一9種。有關(guān)PBP侶的命名后面將要介紹。對大腸桿菌的PBP尹S研究得最清楚(12.13.14)。在大腸桿菌中有7種PBPS,依次為PBPIA、IB產(chǎn)S、2、3、4、5、6。這7個PBPS分別受控于10個不同的染色體遺傳位點(diǎn)。ponA或mrcA決定PBPIA;ponB或mreB控制IBS;pbpA或mrdA與    PBP2產(chǎn)生有關(guān);pbpB或ftsl編碼PBPs;dacB、dacA、dacC三個遺傳位點(diǎn)分別控制PBP4、5、6。PBPIA分子

6、量92KDa,PBPIBC由一系列分子量在90KDa范圍的蛋白質(zhì)組成。PBPIA和IB p在體外兼具有轉(zhuǎn)葡糖基酶和轉(zhuǎn)膚基酶活性,這二種酶在細(xì)菌細(xì)胞壁合成中起重要作用,如果PBPIA和IB;S同時失活則導(dǎo)致細(xì)胞快速裂解死亡。PBP2分子量為66KDa,在間隔區(qū)(septa)細(xì)胞壁合成時具有轉(zhuǎn)膚基酶活性,PBPZ失活,細(xì)胞變成球形體不生長。PBP3的分子量為60KDa,在IBgl隔區(qū)橫壁(eross一wall)合成時有轉(zhuǎn)葡糖基酶或(和)轉(zhuǎn)膚基酶活性。PBP3突變細(xì)胞變成無隔膜的絲狀體。PBP4分子量49KDa,具有次級的轉(zhuǎn)膚基酶、D、D一竣膚酶或D、D一內(nèi)膚酶活性,在膚聚糖成熟中起作用。PBP4變

7、性導(dǎo)致細(xì)胞不能持續(xù)轉(zhuǎn)膚作用。PBPS和6均具有D、D一狡膚酶活性,目前尚未觀察到對于這二個蛋白質(zhì)變性引起的細(xì)菌生理生化反應(yīng)。除上述發(fā)現(xiàn)的7種PBPS外,用碘代青霉素衍生物又檢測到一種新的PBPs,命名為PBPIC,有關(guān)大腸桿菌PBPIC的特點(diǎn)及功能還不清楚(15)。    同時抑制PBP工A與任何一種PBPBS,PBPZ或PBP3均導(dǎo)致生長的大腸桿菌細(xì)胞死亡。所有這些高分子量PBPS均具有體外轉(zhuǎn)膚基酶活性,除PBP2外,其它均具有轉(zhuǎn)葡糖基酶活性,很明顯,所有這些PBPs在大腸桿菌細(xì)胞壁或橫壁合成的催化控制中起重要作用,它們是獨(dú)立的刀一內(nèi)酞胺抗生素殺傷靶位點(diǎn)。

8、60;   二、pBPS分離及純化    每個大腸桿菌細(xì)胞約含105104個PBPS分子,共分成二類,一類為含量豐富的低分子量PBP/s,具有D、D一撥膚酶活性,由于含量豐富,這類PBPs很容易純化。第二類由一些含量較少的高分子量PBPS組成,純化比較困難,而且純化的PBPs在體外常常檢測不到酶活性。    早期用)青霉素標(biāo)記敏感細(xì)菌時發(fā)現(xiàn),青霉素與細(xì)胞膜上少數(shù)高親和力PBPs形成的復(fù)合物在2%SDS、酚水溶液或沸水中可以保持穩(wěn)定,而且既便有過剩的非標(biāo)記一內(nèi)酞胺藥物存在時也不與標(biāo)記的青霉素發(fā)生取代。PBPs能與青霉

9、素衍生物進(jìn)行共價結(jié)合的特性使得人們能用親和層析方法分離純化這些蛋白質(zhì),洗脫劑用經(jīng)胺,因?yàn)榻?jīng)胺是轉(zhuǎn)膚基作用的受體,用這種方法可以純化活性pBPS    Spratt和Pardee(16)發(fā)明一種簡單可重復(fù)性技術(shù)用于PBPs分離。首先用一青霉素標(biāo)記膜制備物,并使之飽和,然后用離子去污劑使之變性(主要防止青霉素一PBP復(fù)合物被酶水解)。用SDS聚丙烯酷胺凝膠電泳分離各PBP產(chǎn)s,根據(jù)分子量的遞減或者在SDS一中泳動速率遞增命名為,PBPI、2n。各種細(xì)菌的PBPs均用此法命名,亞類可用A、B、C等。如PBPI又分為PBP一A、1B和1C。  

10、0; 在膜制備過程中有必要保留PBPs活性。需要說明的是,其它的一內(nèi)酞胺抗生素如甲氧西林(methieillim)、頭抱西丁(Cef-oxitin)、氨葦青霉素以及moxalaetan等也可與膜蛋白結(jié)合,但所有的一內(nèi)酸胺抗生素的靶位點(diǎn)均位于PBP/s之間,尚未發(fā)現(xiàn)一種只與上述抗生素結(jié)合而不與青霉素結(jié)合的膜蛋白。另外實(shí)驗(yàn)表明,在分離PBPs時,用一青霉素進(jìn)行體外標(biāo)記比升青霉素專一性更高。    三、革藍(lán)氏陽性細(xì)菌PBPS改變與細(xì)菌內(nèi)在一內(nèi)酞胺抗性關(guān)系    一般講,革藍(lán)氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁可自由透過一內(nèi)酞胺抗生素,除產(chǎn)生一內(nèi)酞胺酶菌株,革藍(lán)

11、氏陽性菌一般對青霉素敏感。目前產(chǎn)生一內(nèi)酞胺酶的菌株在革藍(lán)氏陽性菌中主要是葡萄球菌,幾乎所有的金黃色葡萄球菌都產(chǎn)生一內(nèi)酞胺酶。由于葡萄球菌產(chǎn)生-內(nèi)酞胺酶,臨床上曾采用甲氧西林取代青霉素,但使用不久就分離到抗甲氧西林的突變株。從英國、美國、意大利、澳大利亞、日本等國分離到的抗甲氧西林金黃色葡萄球菌突變株均發(fā)現(xiàn)含有一個共同的但在正常敏感菌株中不存在的PBP,命名為PBP2 (或PBP2a)(17),分子量約7sKD。,該蛋白質(zhì)對廣譜房內(nèi)酞胺抗生素均具有較低的親和力。該P(yáng)BPZ在SDS一page中位于野生型PBPZ和3之間。    Brown和Reyoolds(18)研究

12、表明,金黃色葡萄球菌表達(dá)甲氧西林抗性受生長條件的影響。在較低溫度(30)或高滲透壓培養(yǎng)基中抗性增加,在低pH值培養(yǎng)基中抗性降低。菌株13136p一m+在30對所有的莊內(nèi)酞胺抗生素均有抗性,但在40則表現(xiàn)正常的敏感型。在30培養(yǎng)時,細(xì)胞膜中出現(xiàn)大量的PBP2,而40生長的細(xì)胞則缺少這種PBP2。因此,Brown提出,當(dāng)其它的FBPs失活后,這種新的低親和力PBP取代了其它PBPs的功能。PBF2存在于所有的已檢測的抗甲氧西林菌株中。除在葡萄球菌中觀察到PBPs改變外,在其它抗性菌株中也發(fā)現(xiàn),如抗鄰氯青霉素(Cloxacillin)枯草芽抱桿菌,相應(yīng)的PBP2a對該種抗生素的親和力降低。在臨床分離

13、到的青霉素抗性產(chǎn)氣英膜梭菌突變株則降低PBPI對青霉素的親和力。因此,在不同的革藍(lán)氏陽性菌中,一內(nèi)酞胺抗生素與不同的PBPs親和力也不同。而有些細(xì)菌表達(dá)這種內(nèi)在的一內(nèi)酸胺抗性機(jī)理要復(fù)雜得多。例如肺炎鏈球菌,該菌不產(chǎn)生莊內(nèi)酸胺酶。用SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳分離肺炎球菌PBPs時發(fā)現(xiàn)敏感型肺炎球菌有5種青霉素結(jié)合蛋白PBPla、lb、2a、2b和3。用同樣方法檢測耐青霉素菌株的PBP產(chǎn)s發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的PBPs的生化特性和對青霉素的親和力均有所改變。耐青霉素菌株的PBPla和1b完全喪失與青霉素的親和力,出現(xiàn)一種新的分子量較小的PBPlc。另外耐藥菌株的2b也被一種新的分子量接近于2a的PBP2a產(chǎn)所代

14、替。為進(jìn)一步研究PBPs與抗藥性之間的關(guān)系。Zighelboim等田分離野生型耐青霉素肺炎球菌8249DNA轉(zhuǎn)化敏感型肺炎球菌受體菌R6。經(jīng)多次轉(zhuǎn)化獲得一系列耐藥水平不同的轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化結(jié)果說明,菌株8249的高耐藥(對青霉素)特征不能通過一次轉(zhuǎn)化傳給R6。而需要進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化才能使R。逐漸獲得較高的抗性性狀。Shoekley等20以及其它的研究者對肺炎球菌耐藥機(jī)理研究也得出相同的結(jié)果。目前對于肺炎球菌有多少遺傳因子與抗藥性有關(guān)還不清楚,但多重轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)逐步獲得高水平耐藥性轉(zhuǎn)化子說明野生型菌株8249攜帶有多重突變的遺傳因子,抗藥性是受多基因控制,那么受體菌需要吸收多個DNA分子以滿足細(xì)胞獲得高水平抗性的需要。這種需要多次轉(zhuǎn)化逐步獲得較高的抗性水平的現(xiàn)象在金黃色葡萄球菌中也得到證實(shí)(17)。    從上述研究不難看出,在革藍(lán)氏陽性細(xì)菌抗性菌株中新出現(xiàn)的低親和力PBPs阻止了內(nèi)酞胺抗生素對細(xì)胞的抑制作用,當(dāng)其它的PBPs由于抗生素結(jié)合而失去活性時,這些低親和力PBPs可以補(bǔ)償其它PBPs的功能。另外,在抗性菌株中,相應(yīng)的PBPs從高抗生素親和力向低親和力方向改變,肺炎鏈球菌PBPs改變是說明這類問題最好的例子。    四、革藍(lán)氏陰性細(xì)菌PBPs改變與細(xì)菌內(nèi)在一內(nèi)耽胺抗性關(guān)系