大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎破骨細(xì)胞分化因子及骨保護(hù)素的基因表達(dá)研究

1、    作者：韓冰，張家穎，武廣恒，徐勇忠【摘要】 目的 本研究以大鼠的類風(fēng)濕性踝關(guān)節(jié)炎為實驗?zāi)Ｐ停捎肦T-PCR技術(shù)檢測大鼠踝關(guān)節(jié)組織中破骨細(xì)胞分化因子(ODF/RANKL)、骨保護(hù)素(OPG)的表達(dá)，探討關(guān)節(jié)組織中RANKL、OPG表達(dá)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨吸收破壞的分子生物學(xué)機制。方法 建立大鼠實驗動物模型。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法，檢測實驗組不同時間大鼠踝關(guān)節(jié)組織中RANKL、OPG mRNA基因表達(dá)。結(jié)果 通過RT-PCR 方法檢測大鼠踝關(guān)節(jié)組織中RANKL及OPG mRNA含量，并對其含量進(jìn)行比較，在正常對照組OPG mR

2、NA的含量高于RANKL mRNA，而隨著模型構(gòu)建成功，RANKL/OPG mRNA的含量比值出現(xiàn)倒置，RANKL mRNA的含量漸升高，其比值4周時為91，6周時為6.41。結(jié)論 隨著關(guān)節(jié)破壞程度的加重，RANKL mRNA組織中的表達(dá)量增加，OPG的表達(dá)量也增加，RANKL/OPG的比值增加程度比OPG增加明顯，在模型建立4周時達(dá)到91，表明RANKL與OPG的表達(dá)比例與破骨細(xì)胞的功能、活性、分化與成熟呈正相關(guān)。局部微環(huán)境中RANKL與OPG的相對比值決定骨組織中破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞功能傾向，決定局部骨組織是吸收、破壞還是增生，而且決定骨的破壞程度。 【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕性踝關(guān)節(jié)炎 破骨細(xì)胞分

3、化因子 骨保護(hù)素 基因表達(dá) Gene expression of osteoclastogenesis inhibitory factor and osteoclast differentiation factor in rat ankle rheumatoid arthritis 【Abstract】 Objective To take the rat ankle rheumatoid arthritis as animal model，and to assay the expression of osteoclast differentiation factor in ankle rheu

4、matoid arthritis(ODF/RANKL)and osteoprotegerin(OPG)in the rat ankle tissue by the means of molecular biology.To discuss the relationship between extent of bone tissue destruction and expression of RANKL and OPG，and to discuss the molecular biology mechanism of bone tissue destruction in rheumatoid a

5、rthritis.Methods The rat animal model was established.The variety of RANKL and OPG expression by means of RT-PCR was assayed.Results With the inflammation worsening and the bone destruction， the RANKL mRNA expressional quality was arisen.By comparing the expression of RANKL mRNA with that of OPG mRN

6、A， we could draw a conclusion that the values in normal control group were changed into invert ratio when the joint inflammation was worse. And the ratio was 91 when it come to its climax. Conclusion With the increase of deterioration of the bone destruction，the ratio of RANKL/OPG is increased littl

7、e by little，and the ratio comes to 91 when inducing the animal model at the forth week. Regulated the extent of bone destruction by means of negative-feed， bone absorption or hyperplasia and the extent of the bone destruction depend on the ratio of RANKL and OPG in the local microenvironment. 【Key w

8、ords】 ankle rheumatoid arthritis osteoclast differentiation factor osteoprotegerin gene expression 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA) 表現(xiàn)為慢性、對稱性多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變的一種自身免疫、炎性疾病。病情進(jìn)展中綜合體現(xiàn)了炎癥、自身免疫、滑膜組織增生3種病理生理過程。許多證據(jù)表明，骨吸收是破骨細(xì)胞在成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)參與下侵蝕骨質(zhì)的生物學(xué)功能，體現(xiàn)OB 的接觸依賴過程。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的細(xì)胞間接觸是決定破骨細(xì)胞形成及功能活動的必要條件。因而，人們

9、推測在成骨細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在著一種膜結(jié)合因子，可以介導(dǎo)成骨細(xì)胞對破骨細(xì)胞分化及功能的調(diào)控，這一假設(shè)及其確切的分子機制直到近期才得以證實。1997年Simonet等在胎鼠小腸組織構(gòu)建的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了一種新的TNF受體家族成員，它具有降低破骨細(xì)胞分化和增加骨密度的功能，故命名為護(hù)骨因子(osteoprotegerin， OPG)， 破骨細(xì)胞發(fā)生抑制因子(osteoclastogensis inhibitory factor，OCIF)。1998年有2個研究組分別發(fā)現(xiàn)了一種新的破骨細(xì)胞分化所必需的因子，分別將其命名為破骨細(xì)胞分化因子(osteoclast differentiation fac

10、tor， ODF)、OPG配體(osteoprotegerin ligand， OPGL)，RANKL/ODF被認(rèn)為可能是唯一能夠直接誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和功能的細(xì)胞因子5。本實驗是應(yīng)用牛型膠原蛋白與弗氏佐劑為乳劑，制備Wistar大鼠類風(fēng)濕性踝關(guān)節(jié)炎模型，應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)檢測大鼠關(guān)節(jié)組織中ODF/RANKL mRNA及OPG mRNA表達(dá)，從分子生物學(xué)水平探討類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨吸收破壞機制，為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨吸收破壞機制的進(jìn)一步探討及早期診斷奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 一般材料 1.1.1 實驗動物 Wistar大鼠48只，雌性，5周齡，體重約(120±15)g

11、左右，由長春高新醫(yī)學(xué)實驗研究中心提供，隨機分成正常對照組、實驗組各24只。 1.1.2 主要試劑 (1)牛源性型膠原蛋白(collagen )，酸可溶性，美國Sigma公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑(complete Freunds adjuvant，CFA)，美國Sigma公司產(chǎn)品。 1.1.3 逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase 抑制劑和Trizol試劑 購自寶生物工程大連有限公司。 1.1.4 特異引物 由寶生物工程大連有限公司合成。(1)RANKL 擴增產(chǎn)物長度為822bp，引物順序如下：上游引物：5-GAGACTACGGCAAGTA-3；下游引物：5-CCTCCAACGTTTATGG -3。(2)OPG

12、引物擴增產(chǎn)物長度為 603bp順序如下：上游引物：5-TGGAGCTCGAATTCTGCTTG-3；下游引物：5-CATCAAGATGCGGAGCTGCT-3。(3)大鼠-actin引物擴增產(chǎn)物長度為410bp，順序如下： 上游引物：5-GAAATCGTGCGTGACATTAAG-3；下游引物：5-CTAGAAGCATTTGCGGTGCA-3。-actin 作為檢測RANKL、OPG內(nèi)參對照。 1.2 實驗方法 1.2.1 實驗組織制備 不同時間點實驗組大鼠（0、2、4、6周）兩側(cè)踝關(guān)節(jié)組織取出后，右側(cè)用10福爾馬林固定后，用于活組織檢查。左側(cè)踝關(guān)節(jié)組織放入液氮罐內(nèi)以備用來做分子生物學(xué)指標(biāo)檢測

13、。 1.2.2 組織總RNA提取 紫外分光光度計測定RNA含量和純度RT-PCR檢測RANKL、OPG、CTR mRNA基因表達(dá)，利用基因公司凝膠成像分析系統(tǒng)2 結(jié)果見圖1，2，3。圖中0周組為實驗對照組，2、4、6周組為異種膠原誘導(dǎo)注射后各不同時間實驗組。 RANKL mRNA 在正常對照組微弱表達(dá)，隨著關(guān)節(jié)炎癥狀和關(guān)節(jié)骨吸收程度的加重而升高，表達(dá)量在誘導(dǎo)注射第4周時達(dá)到高峰，6周時由于吸收破壞仍繼續(xù)，RANKL mRNA 的含量繼續(xù)處于高值。見圖1。 圖1 RT-PCR檢測大鼠RANKL mRNA表達(dá) OPG mRNA在正常對照組呈弱表達(dá)，隨關(guān)節(jié)破壞程度加重，其表達(dá)量漸升高。見圖2。 圖2 RT-PCR檢測大鼠OPG mPNA表達(dá) 圖1，2各泳道如下：M：DL-2000；1：對照組；2、3、4：分別為誘導(dǎo)注射2周、4周和6周組。    RANKL與OPG mRNA的含量進(jìn)行比較，可以看出，在正常對照組OPG mRNA的含量高于RANKL mRNA的含量，RANKL與OPG比值為12，而當(dāng)大鼠異種膠