第章沉淀反應(yīng)ppt課件

1、 第五章沉淀反響第五章沉淀反響 (precipitation (precipitation reaction)reaction) 指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀景象。發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀景象。沉淀反響沉淀反響+ +- -l構(gòu)成肉眼可見的大的構(gòu)成肉眼可見的大的免疫復(fù)合物免疫復(fù)合物, ,反響慢。反響慢。l沉淀線或沉淀環(huán)的察沉淀線或沉淀環(huán)的察看以及免疫比濁法中的看以及免疫比濁法中的終點(diǎn)法就是測定此階段終點(diǎn)法就是測定此階段構(gòu)成的復(fù)合物構(gòu)成的復(fù)合物第一階段第一階段第二階段第二階段沉淀反響分兩個(gè)階段沉淀反響分兩個(gè)階段l抗原抗體特異性結(jié)合

2、，抗原抗體特異性結(jié)合，快速但不可見?？焖俚豢梢姟免疫比濁法中的速率免疫比濁法中的速率法就是利用此階段測定法就是利用此階段測定免疫復(fù)合物構(gòu)成的速率。免疫復(fù)合物構(gòu)成的速率。沉淀反響的原理沉淀反響的原理抗原與抗體反響抗原與抗體反響n多克隆抗體非常適用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。多克隆抗體非常適用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。n單克隆抗體單克隆抗體n抗原外表只需一種表位，不易構(gòu)成交聯(lián)，抗原外表只需一種表位，不易構(gòu)成交聯(lián)，n 單克隆抗體普通不適用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，單克隆抗體普通不適用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，n抗原外表有抗原外表有2 2個(gè)以上一樣的表位，單克隆抗個(gè)以上一樣的表位，單克隆抗體也可用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。體也可用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。n

3、R R型抗體：沉淀反響中多用。型抗體：沉淀反響中多用。環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)絮狀沉淀實(shí)驗(yàn)絮狀沉淀實(shí)驗(yàn)單向分散實(shí)驗(yàn)單向分散實(shí)驗(yàn)雙向分散實(shí)驗(yàn)雙向分散實(shí)驗(yàn)對流免疫電泳、火箭免疫電泳、對流免疫電泳、火箭免疫電泳、免疫電泳、免疫固定電泳免疫電泳、免疫固定電泳液相沉淀液相沉淀實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)z沉淀凝膠沉淀實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)免疫電泳免疫電泳實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)沉淀反響分類沉淀反響分類免疫濁度免疫濁度實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)免疫投射濁度測定免疫投射濁度測定免疫散射濁度測定免疫散射濁度測定第一節(jié)液相沉淀實(shí)驗(yàn)第一節(jié)液相沉淀實(shí)驗(yàn) 自學(xué)自學(xué)n液相沉淀實(shí)驗(yàn)n 是指可溶性抗原與抗體在含電解質(zhì)的液體介質(zhì)中反響，構(gòu)成肉眼可見的沉淀物。n經(jīng)典的液相沉淀實(shí)驗(yàn)：n 絮狀沉

4、淀實(shí)驗(yàn)n 環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)第二節(jié)凝膠沉淀實(shí)驗(yàn)第二節(jié)凝膠沉淀實(shí)驗(yàn)gel phase gel phase precipitationprecipitation|指可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中分散，指可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中分散，構(gòu)成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度構(gòu)成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢脴?gòu)成肉眼可見的沉淀線或比例適當(dāng)?shù)奈恢脴?gòu)成肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)。沉淀環(huán)。|常用的凝膠：瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚常用的凝膠：瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠。丙烯酰胺凝膠。原原 理理n凝膠孔徑3nm，抗原或抗體分子AgAbAgC CAbAb、AgAg近似近似AgAb AgAb D DA

5、gAbAgAbAbAb、AgAg近似近似E EAgAbAgAbAgAbAgAbF FAgAbAgAbAgAb5.抗原性質(zhì)分析抗原性質(zhì)分析A:A:兩條沉淀線完全交融，闡明抗體與兩個(gè)抗原中的一樣表位兩條沉淀線完全交融，闡明抗體與兩個(gè)抗原中的一樣表位結(jié)合而沉淀，但這并不意為著兩個(gè)抗原必定完全一樣。結(jié)合而沉淀，但這并不意為著兩個(gè)抗原必定完全一樣。B:B:沉淀線交叉，闡明兩個(gè)抗原完全不同；沉淀線交叉，闡明兩個(gè)抗原完全不同；C:C:兩條沉淀線相切，闡明兩個(gè)抗原部分一樣，二者都有表位兩條沉淀線相切，闡明兩個(gè)抗原部分一樣，二者都有表位1 1，但其中另一個(gè)抗原還含有表位，但其中另一個(gè)抗原還含有表位2 2。|操作

6、簡單，無需特殊設(shè)備。|特異性高，結(jié)果可靠，本錢低廉。|靈敏度低，耗時(shí)長，不能準(zhǔn)確定量。評評 價(jià)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 1.1.加快反響的速度。加快反響的速度。 2.2.提高了靈敏度。提高了靈敏度。3.3.添加了分辨率。添加了分辨率。 電泳分析電泳分析沉淀反響沉淀反響抗原抗體反響抗原抗體反響的高度特異性的高度特異性電泳技術(shù)的高分辨電泳技術(shù)的高分辨率、快速、微量率、快速、微量第三節(jié)第三節(jié) 免疫電泳技術(shù)免疫電泳技術(shù)原理：原理： 雙向分散雙向分散+ +電泳電泳在在pH8.6pH8.6的瓊脂凝膠中，的瓊脂凝膠中，抗原蛋白：等電點(diǎn)抗原蛋白：等電點(diǎn)4 45 5，帶較多的，帶較多的“- -，且分子，且分子較小，向正極

7、的泳動(dòng)速度大于向負(fù)極的電滲，抗較小，向正極的泳動(dòng)速度大于向負(fù)極的電滲，抗原泳向正極；原泳向正極；抗體蛋白：等電點(diǎn)較高，帶較少的負(fù)電荷，且分抗體蛋白：等電點(diǎn)較高，帶較少的負(fù)電荷，且分子較大，向正極的泳動(dòng)速度小于向負(fù)極的電滲，子較大，向正極的泳動(dòng)速度小于向負(fù)極的電滲，抗體泳向負(fù)極?？贵w泳向負(fù)極。一、對流免疫電泳一、對流免疫電泳通電通電AgAg蛋白質(zhì)抗原常蛋白質(zhì)抗原常帶較強(qiáng)的負(fù)電帶較強(qiáng)的負(fù)電荷，在電場中荷，在電場中向正極挪動(dòng)向正極挪動(dòng)抗體球蛋白抗體球蛋白帶負(fù)電荷較少，帶負(fù)電荷較少，籍電滲作用向籍電滲作用向負(fù)極泳動(dòng)負(fù)極泳動(dòng)AbAb正極正極負(fù)極負(fù)極對流免疫電泳原理對流免疫電泳原理沉淀線沉淀線運(yùn)用與評價(jià)運(yùn)

8、用與評價(jià)n用于抗原或抗體的定性分析、效價(jià)測定和純度鑒定等。n靈敏度比雙向免疫分散實(shí)驗(yàn)高816倍。n分辨力低于雙向免疫分散實(shí)驗(yàn)。n不適宜于抗原為免疫球蛋白的情況，因這會(huì)導(dǎo)致電泳時(shí)抗原抗體朝一個(gè)方向泳動(dòng)。電泳時(shí)凝膠中抗體不挪動(dòng)，樣品孔中的抗原向電泳時(shí)凝膠中抗體不挪動(dòng)，樣品孔中的抗原向正極泳動(dòng)，隨著抗原量的逐漸減少，抗原泳動(dòng)正極泳動(dòng)，隨著抗原量的逐漸減少，抗原泳動(dòng)的基底區(qū)越來越窄，抗原抗體分子復(fù)合物構(gòu)成的基底區(qū)越來越窄，抗原抗體分子復(fù)合物構(gòu)成的沉淀線逐漸變窄，構(gòu)成一個(gè)外形如火箭的不的沉淀線逐漸變窄，構(gòu)成一個(gè)外形如火箭的不溶性復(fù)合物沉淀峰，抗體濃度固定時(shí)，峰的高溶性復(fù)合物沉淀峰，抗體濃度固定時(shí)，峰的高

9、度與抗原量呈正相關(guān)。度與抗原量呈正相關(guān)。 原理原理單向免疫分散電泳單向免疫分散電泳, ,定量檢測技術(shù)定量檢測技術(shù)二、火箭免疫電泳二、火箭免疫電泳火箭免疫電泳圖火箭免疫電泳圖為規(guī)范抗原；為標(biāo)本為規(guī)范抗原；為標(biāo)本- -+ +火箭免疫電泳表示圖火箭免疫電泳表示圖運(yùn)用與評價(jià)運(yùn)用與評價(jià)n用于抗原蛋白定量，如IgA、IgG、IgM和SIgA，C3和C4及其裂解產(chǎn)物，AFP等。n假設(shè)瓊脂中加定量抗原可檢測標(biāo)本中抗體的含量，稱為反向火箭免疫電泳reversed rocket immunoelectrophoresis。n本法影響要素多，現(xiàn)運(yùn)用較少。原理：區(qū)帶電泳雙向分散原理：區(qū)帶電泳雙向分散1 1、電泳：將蛋

10、白質(zhì)抗原在凝膠中電泳、電泳：將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中電泳分成肉眼不可見的假設(shè)干區(qū)帶分成肉眼不可見的假設(shè)干區(qū)帶 2 2、雙擴(kuò)：沿電泳方向挖一與之平行的、雙擴(kuò)：沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，參與相應(yīng)抗血清進(jìn)展雙向分抗體槽，參與相應(yīng)抗血清進(jìn)展雙向分散散 。 三、免疫電泳三、免疫電泳+ +- -抗體槽抗體槽Ag+ +- -+ +1.1.電泳分別抗原電泳分別抗原2.2.在槽內(nèi)加抗血清在槽內(nèi)加抗血清3.3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果- -+ +M M：骨髓瘤患者血清免疫電泳圖：骨髓瘤患者血清免疫電泳圖 N N：正常人血清免疫電泳圖：正常人血清免疫電泳圖應(yīng)應(yīng) 用用純化抗原或抗體的成分分純化抗原或抗體的成分分析，粗略檢測

11、其純度。析，粗略檢測其純度。正常和異常體液中蛋白質(zhì)正常和異常體液中蛋白質(zhì)組成分析，如無丙種球蛋組成分析，如無丙種球蛋白血癥、多發(fā)性骨髓瘤等白血癥、多發(fā)性骨髓瘤等病人的血清蛋白成分分析；病人的血清蛋白成分分析；不同抗體成分的研討，如不同抗體成分的研討，如免疫后抗體組分的動(dòng)態(tài)變免疫后抗體組分的動(dòng)態(tài)變化?；?。評評 價(jià)價(jià)n方法簡單，樣品用量方法簡單，樣品用量少，特異性高，分辨少，特異性高，分辨率高，可分出人血清率高，可分出人血清中中20203030種蛋白質(zhì)。種蛋白質(zhì)。n沉淀線的數(shù)目和分辨沉淀線的數(shù)目和分辨率受多種要素的影響，率受多種要素的影響，斷定結(jié)果要慎重。斷定結(jié)果要慎重。四、自動(dòng)化免疫電泳四、自動(dòng)

12、化免疫電泳1.1.電泳系統(tǒng)電泳系統(tǒng)2.2.光密度掃描系統(tǒng)光密度掃描系統(tǒng)第四節(jié)免疫濁度測定第四節(jié)免疫濁度測定n運(yùn)用抗原、抗體在液相中特異性反響，構(gòu)運(yùn)用抗原、抗體在液相中特異性反響，構(gòu)成免疫復(fù)合物微粒對光線的干擾，可用儀成免疫復(fù)合物微粒對光線的干擾，可用儀器檢測的特點(diǎn)，對可溶性抗原定量，將現(xiàn)器檢測的特點(diǎn)，對可溶性抗原定量，將現(xiàn)代光學(xué)儀器與自動(dòng)化分析檢測系統(tǒng)相結(jié)合代光學(xué)儀器與自動(dòng)化分析檢測系統(tǒng)相結(jié)合運(yùn)用于沉淀反響。運(yùn)用于沉淀反響。n特點(diǎn)：操作簡便、快速、易于自動(dòng)化，而特點(diǎn)：操作簡便、快速、易于自動(dòng)化，而且靈敏度較高。且靈敏度較高。根本原理根本原理n在抗體過量且固定的條件下，構(gòu)成的免疫復(fù)合物量隨抗原在

13、抗體過量且固定的條件下，構(gòu)成的免疫復(fù)合物量隨抗原量添加而添加，反響液的濁度亦隨之加強(qiáng)，即待測抗原量量添加而添加，反響液的濁度亦隨之加強(qiáng)，即待測抗原量與反響后溶液的濁度呈正相關(guān)。與反響后溶液的濁度呈正相關(guān)。n用一系列知濃度的抗原規(guī)范品進(jìn)展實(shí)驗(yàn)，制備劑量用一系列知濃度的抗原規(guī)范品進(jìn)展實(shí)驗(yàn)，制備劑量- -反響曲反響曲線，即求出標(biāo)本中抗原含量。線，即求出標(biāo)本中抗原含量。小分子可溶性免疫復(fù)合物小分子可溶性免疫復(fù)合物19S反響液出現(xiàn)濁度反響液出現(xiàn)濁度增濁劑增濁劑可溶性抗原可溶性抗原 + 抗體抗體n根據(jù)檢測器的位置及其所檢測的光信號(hào)性質(zhì)不同，免疫濁根據(jù)檢測器的位置及其所檢測的光信號(hào)性質(zhì)不同，免疫濁度測定分為

14、：度測定分為：n 免疫透射濁度測定免疫透射濁度測定turbidimetryturbidimetry：檢測透射光強(qiáng)度：檢測透射光強(qiáng)度n 免疫散射濁度測定免疫散射濁度測定nephelometrynephelometry：檢測散射光強(qiáng)度：檢測散射光強(qiáng)度一、免疫透射濁度測定一、免疫透射濁度測定一原理一原理一定波長的入射光線經(jīng)過抗原抗體反響后的混合液時(shí)，一定波長的入射光線經(jīng)過抗原抗體反響后的混合液時(shí)，被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收、衍射、反射和折射被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收、衍射、反射和折射而減弱，在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈而減弱，在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而構(gòu)成的免疫復(fù)合物量與

15、參與反響的抗原正相關(guān)，而構(gòu)成的免疫復(fù)合物量與參與反響的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。與知濃度的抗原規(guī)范品比和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。與知濃度的抗原規(guī)范品比較，可確定標(biāo)本中抗原含量。較，可確定標(biāo)本中抗原含量。免疫復(fù)合物顆粒大小約免疫復(fù)合物顆粒大小約35nm35nm100nm100nm，對近紫外光的，對近紫外光的干擾最大最大吸收峰，選擇干擾最大最大吸收峰，選擇290nm290nm410nm410nm波長波長測定最正確，目前多用測定最正確，目前多用340nm340nm。二技術(shù)要點(diǎn)二技術(shù)要點(diǎn)1.1.將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋；將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋；2.2.將抗原規(guī)范液將抗原規(guī)范液5 5或或6

16、 6個(gè)濃度和待檢標(biāo)本個(gè)濃度和待檢標(biāo)本與適當(dāng)過量的抗血清混合，在一定條件下，與適當(dāng)過量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反響完成后，在抗原抗體反響完成后，在340nm340nm處測定各管處測定各管吸光度；吸光度；3.3.按按log-logitlog-logit轉(zhuǎn)換或轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+dy=ax3+bx2+cx+d方程進(jìn)方程進(jìn)展曲線擬合，制備劑量展曲線擬合，制備劑量- -反響曲線，以此作反響曲線，以此作為標(biāo)本中抗原的定量根據(jù)。為標(biāo)本中抗原的定量根據(jù)。 三本卷須知三本卷須知1.在標(biāo)本搜集、保管和處置過程中，需防灰塵等能散射光的物質(zhì)。2.血清樣品最好在稀釋后測定。3.計(jì)算時(shí)需扣除標(biāo)本、

17、抗血清和試劑本底。4.每改換一批試劑，重新制造劑量-反響曲線。三方法評價(jià)三方法評價(jià) 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): : 靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確。靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確。 缺乏缺乏: : 抗體用量較大；抗體用量較大； 溶液中存在的抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大溶液中存在的抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大 透射比濁測定在抗原抗體反響的第二階段，檢透射比濁測定在抗原抗體反響的第二階段，檢 測需在抗原抗體反響到達(dá)平衡后進(jìn)展，耗時(shí)較長。測需在抗原抗體反響到達(dá)平衡后進(jìn)展，耗時(shí)較長。 1.粒子對光線的散射作用：粒子對光線的散射作用：溶液中的微粒子遭到光線照射后，微粒子對光線產(chǎn)溶液中的微粒子遭到光線照射后，

18、微粒子對光線產(chǎn)生反射和折射而構(gòu)成散射光。生反射和折射而構(gòu)成散射光。懸浮微粒對光散射構(gòu)成的散射光強(qiáng)度與微粒的大小、懸浮微粒對光散射構(gòu)成的散射光強(qiáng)度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長和強(qiáng)度、丈量角度等要素親密數(shù)量、入射光的波長和強(qiáng)度、丈量角度等要素親密相關(guān)，其公式如下：相關(guān)，其公式如下：二、免疫散射比濁法二、免疫散射比濁法( (一一) ) 原理原理I：與入射光成：與入射光成角處散射光強(qiáng)度；角處散射光強(qiáng)度；和和I0：為入射光的波長和強(qiáng)度；：為入射光的波長和強(qiáng)度；dn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；M為顆粒分子量；為顆粒分子量； c為

19、濃度；為濃度；N為阿佛加德指數(shù)；為阿佛加德指數(shù)；為顆粒到檢測器的間隔；為顆粒到檢測器的間隔；為散射光與入射光的夾角散射夾角。為散射光與入射光的夾角散射夾角。II042dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24nRayleighRayleigh散射：當(dāng)粒徑小于入射光波長的散射：當(dāng)粒徑小于入射光波長的1/101/10時(shí)，散射光時(shí)，散射光強(qiáng)度在各個(gè)方向的分布均勻一致強(qiáng)度在各個(gè)方向的分布均勻一致nDebyeDebye散射：當(dāng)粒徑大于入射光波長的散射：當(dāng)粒徑大于入射光波長的1/101/10或接近入射光或接近入射光波長時(shí)，散射光呈明顯的不均勻分布，向前散射光大于向波長時(shí)，散射光呈明顯的不均勻分布，向前散

20、射光大于向后散射光后散射光nMieMie散射：當(dāng)粒徑等于或大于入射光波長時(shí)，向前散射光散射：當(dāng)粒徑等于或大于入射光波長時(shí)，向前散射光遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于向后散射光。遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于向后散射光。310310900900DebyeDebye散射散射2.免疫散射濁度測定對抗原定量的原理免疫散射濁度測定對抗原定量的原理n一定波長的光線沿程度軸經(jīng)過抗原抗體反響混合液時(shí)，由于反響液中免疫復(fù)合物微粒對光線的衍射和折射而構(gòu)成散射光，散射光強(qiáng)度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)。n在抗體過量的情況下，免疫復(fù)合物量與參與反響的抗原量呈正相關(guān)，與知濃度的抗原規(guī)范品比較，即可計(jì)算出標(biāo)本中抗原含量。n現(xiàn)用散射比濁儀丈量散射光的角度多采用550，丈量向

21、前散射光。1.1.終點(diǎn)散射比濁法終點(diǎn)散射比濁法 (end-point nephelometry)(end-point nephelometry)2.2.固定時(shí)間散射比濁法固定時(shí)間散射比濁法 fixed time ephelometryfixed time ephelometry3.3.速率散射比濁法速率散射比濁法rate nephelometryrate nephelometry二方二方 法法原理：在抗原抗體反響到達(dá)平衡時(shí)測定散射原理：在抗原抗體反響到達(dá)平衡時(shí)測定散射光強(qiáng)度。必需在免疫復(fù)合物相互聚合構(gòu)成光強(qiáng)度。必需在免疫復(fù)合物相互聚合構(gòu)成絮狀沉淀之前進(jìn)展?jié)岫葴y定，以免光散射絮狀沉淀之前進(jìn)展?jié)岫?/p>

22、測定，以免光散射值降低，得出偏低的結(jié)果。值降低，得出偏低的結(jié)果。1.1.終點(diǎn)散射比濁法終點(diǎn)散射比濁法反響時(shí)間較速率法稍長；反響時(shí)間較速率法稍長；可自動(dòng)化；可自動(dòng)化；計(jì)算時(shí)需求減去本底值；計(jì)算時(shí)需求減去本底值；檢測限達(dá)微克程度檢測限達(dá)微克程度g/Lg/L，但低于速，但低于速率散射比濁法。率散射比濁法。1技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn)將待檢標(biāo)本和抗原規(guī)范品將待檢標(biāo)本和抗原規(guī)范品作適當(dāng)稀釋；作適當(dāng)稀釋；標(biāo)本和抗原規(guī)范液標(biāo)本和抗原規(guī)范液5 5或或6 6個(gè)濃度與抗血清混合，在個(gè)濃度與抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反響一定條件下，抗原抗體反響完成后，散射比濁儀測定反完成后，散射比濁儀測定反響液的散射光強(qiáng)度；響液的散

23、射光強(qiáng)度；與抗原規(guī)范品比較，確定與抗原規(guī)范品比較，確定標(biāo)本中抗原含量。標(biāo)本中抗原含量。2方法評價(jià)方法評價(jià)n原理：在保證抗體過量的情況下，參與待測抗原理：在保證抗體過量的情況下，參與待測抗原，此時(shí)反響立刻開場，在反響的第一階段，原，此時(shí)反響立刻開場，在反響的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號(hào)動(dòng)搖較大，所獲取的溶液中產(chǎn)生的散射光信號(hào)動(dòng)搖較大，所獲取的信號(hào)計(jì)算出的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。定時(shí)散信號(hào)計(jì)算出的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。定時(shí)散射比濁法是避開抗原抗體反響的不穩(wěn)定階段，射比濁法是避開抗原抗體反響的不穩(wěn)定階段，即散射光信號(hào)在開場反響即散射光信號(hào)在開場反響7.5s7.5s2min2min內(nèi)的第一內(nèi)的第一次

24、讀數(shù)，專門在抗原抗體反響的最正確時(shí)段進(jìn)次讀數(shù)，專門在抗原抗體反響的最正確時(shí)段進(jìn)展讀數(shù)，將檢測誤差降到最低。展讀數(shù)，將檢測誤差降到最低。 2. 固定時(shí)間散射比濁法固定時(shí)間散射比濁法技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn) 抗原抗體預(yù)反響：少量非常之一標(biāo)本抗原抗體預(yù)反響：少量非常之一標(biāo)本與一定量抗體混合反響，幾秒鐘后測定散與一定量抗體混合反響，幾秒鐘后測定散射光信號(hào)，假設(shè)信號(hào)值超越預(yù)設(shè)閾值，提射光信號(hào)，假設(shè)信號(hào)值超越預(yù)設(shè)閾值，提示標(biāo)本中待測抗原濃度過高，應(yīng)將標(biāo)本適示標(biāo)本中待測抗原濃度過高，應(yīng)將標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重做；當(dāng)稀釋后重做；參與全量標(biāo)本，幾分鐘后再測定散射光信參與全量標(biāo)本，幾分鐘后再測定散射光信號(hào)；號(hào)； 以第二次測得的

25、信號(hào)值減去第一次信號(hào)值，以第二次測得的信號(hào)值減去第一次信號(hào)值，獲得待測抗原獲得待測抗原-抗體復(fù)合物產(chǎn)生的信號(hào)值，抗體復(fù)合物產(chǎn)生的信號(hào)值，經(jīng)計(jì)算機(jī)處置轉(zhuǎn)換為抗原濃度。經(jīng)計(jì)算機(jī)處置轉(zhuǎn)換為抗原濃度。3.速率散射比濁法速率散射比濁法rate nephelometryn速率：指單位時(shí)間內(nèi)抗原抗體特異結(jié)合構(gòu)成分子量大于3106的免疫復(fù)合物量不是累積量。n抗原與抗體混合的瞬間便引發(fā)反響，開場有數(shù)秒的滯后時(shí)間，隨后反響加快，在抗體過量的前提下，抗原抗體反響速度由慢到快，單位時(shí)間內(nèi)構(gòu)成的免疫復(fù)合物不斷增多，隨后又逐漸減慢，延續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測單位時(shí)間內(nèi)構(gòu)成的免疫復(fù)合物微粒產(chǎn)生的散射光強(qiáng)度，可發(fā)如今某一單位時(shí)間內(nèi)抗原抗體

26、反響速度最快、免疫復(fù)合物構(gòu)成量最多、散射光強(qiáng)度最大，即為所謂的速率峰，該峰值大小與抗原濃度呈正相關(guān)。 抗原抗體復(fù)合物構(gòu)成的速率抗原抗體復(fù)合物構(gòu)成的速率累計(jì)時(shí)間累計(jì)時(shí)間s構(gòu)成構(gòu)成IC總量速率總量速率累計(jì)時(shí)間累計(jì)時(shí)間s構(gòu)成構(gòu)成IC總量速率總量速率 5 5 8 81010 1313 5 51515 252512122020 606035352525 15015090903030 23023080803535 300 300 70704040 360360 60604545 415415 55555050 450450 45455555 480480 30306060 500500 20201技術(shù)要點(diǎn)

27、技術(shù)要點(diǎn) 將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋；將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋；開啟機(jī)器，對儀器定標(biāo)；開啟機(jī)器，對儀器定標(biāo)；將待測標(biāo)本和抗血清分別放入樣本盤和試將待測標(biāo)本和抗血清分別放入樣本盤和試劑盤，輸入命令，選擇檢測工程，儀器自劑盤，輸入命令，選擇檢測工程，儀器自動(dòng)取一定量標(biāo)本和適量抗血清混合，并動(dòng)動(dòng)取一定量標(biāo)本和適量抗血清混合，并動(dòng)態(tài)監(jiān)測反響液的速率變化，微電腦對丈量態(tài)監(jiān)測反響液的速率變化，微電腦對丈量數(shù)據(jù)自動(dòng)分析處置，即可得知標(biāo)本中抗原數(shù)據(jù)自動(dòng)分析處置，即可得知標(biāo)本中抗原含量。含量。2方法評價(jià)方法評價(jià) 本法為自動(dòng)化免疫化學(xué)分析技術(shù)，具有本法為自動(dòng)化免疫化學(xué)分析技術(shù)，具有快速普通在快速普通

28、在3060s內(nèi)即可完成測試、內(nèi)即可完成測試、靈敏最小檢出量達(dá)靈敏最小檢出量達(dá)g/L、準(zhǔn)確、精細(xì)、準(zhǔn)確、精細(xì)度高、穩(wěn)定性好、節(jié)省試劑、檢測范圍廣、度高、穩(wěn)定性好、節(jié)省試劑、檢測范圍廣、不需減去樣本和試劑本底值等優(yōu)點(diǎn)；但在不需減去樣本和試劑本底值等優(yōu)點(diǎn)；但在實(shí)踐運(yùn)用中，測定結(jié)果與儀器的性能和試實(shí)踐運(yùn)用中，測定結(jié)果與儀器的性能和試劑的質(zhì)量親密相關(guān)，特別對抗體的質(zhì)量要?jiǎng)┑馁|(zhì)量親密相關(guān)，特別對抗體的質(zhì)量要求高。求高。BN ProSpec全自動(dòng)特定蛋白分析儀全自動(dòng)特定蛋白分析儀IMMAGE全自動(dòng)特定蛋白分析儀全自動(dòng)特定蛋白分析儀n為一種帶載體的免疫比濁法。為一種帶載體的免疫比濁法。n在普通的免疫濁度測定中

29、，少量小分子免疫復(fù)合在普通的免疫濁度測定中，少量小分子免疫復(fù)合物極難構(gòu)成濁度，要構(gòu)成較大的免疫復(fù)合物，需物極難構(gòu)成濁度，要構(gòu)成較大的免疫復(fù)合物，需參與反響的抗原、抗體量較大，這顯然不符合微參與反響的抗原、抗體量較大，這顯然不符合微量化的要求，為提高免疫濁度測定的靈敏度，開量化的要求，為提高免疫濁度測定的靈敏度，開展了免疫膠乳粒子加強(qiáng)濁度測定。展了免疫膠乳粒子加強(qiáng)濁度測定。三、免疫膠乳粒子加強(qiáng)濁度測定三、免疫膠乳粒子加強(qiáng)濁度測定用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒普通為用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒普通為0.2 m0.2 m，在遇到相應(yīng)抗原時(shí)，膠乳顆粒上的抗體與抗，在遇到相應(yīng)抗原時(shí)

30、，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚，使透射光和散射光即原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。出現(xiàn)顯著變化。如下圖：如下圖：a a為單個(gè)膠乳顆粒不妨礙光線透過，為單個(gè)膠乳顆粒不妨礙光線透過，b b為抗原抗為抗原抗體結(jié)合構(gòu)成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光加體結(jié)合構(gòu)成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光加強(qiáng)。強(qiáng)。 一原理：一原理：Ab致敏的顆粒ab二測定方法二測定方法 三方法評價(jià)三方法評價(jià)n敏感度大大高于普通比濁法，可達(dá)ng/L程度；n操作簡便，易自動(dòng)化；n血清中C1q和RF可與IgG Fc段結(jié)合，使IgG致敏膠乳顆粒出現(xiàn)非特異性凝集，用F(ab)2片段

31、替代IgG既可消除此干擾，又可抑制IgG致敏膠乳的自凝景象；n免疫膠乳輕度自凝或免疫活性降低會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果。1.透射比濁法：測定透射光強(qiáng)度2.散射比濁法：測定散射光強(qiáng)度四、免疫速率抑制濁度測定自學(xué)四、免疫速率抑制濁度測定自學(xué)l競爭抑制實(shí)驗(yàn)，用于藥物、激素和毒物等小分子半抗原物質(zhì)的定量測定。l根本原理：讓一定量的知半抗原-載體與限量的特異性抗體反響，生成的載體-半抗原-抗體復(fù)合物可產(chǎn)生一定的光散射速率峰值。當(dāng)向反響系統(tǒng)中參與標(biāo)本時(shí)，待測半抗原與半抗原-載體競爭結(jié)合相應(yīng)抗體，從而抑制載體-半抗原-抗體復(fù)合物的構(gòu)成，使光散射速率峰值降低，其降低的程度與待測半抗原量成正相關(guān)。五、免疫濁度測定的主要影響

32、要素五、免疫濁度測定的主要影響要素一抗原抗體比例一抗原抗體比例鉤狀效應(yīng)：當(dāng)抗原過量時(shí)，構(gòu)成的免疫復(fù)合物分子小，鉤狀效應(yīng)：當(dāng)抗原過量時(shí)，構(gòu)成的免疫復(fù)合物分子小，而且會(huì)發(fā)生解離，使?jié)岫确炊陆?，光散射件減少，而且會(huì)發(fā)生解離，使?jié)岫确炊陆?，光散射件減少，構(gòu)成高劑量鉤狀效應(yīng)。構(gòu)成高劑量鉤狀效應(yīng)。海德堡曲線：當(dāng)抗體過量時(shí)，復(fù)合物的構(gòu)成隨著抗原海德堡曲線：當(dāng)抗體過量時(shí)，復(fù)合物的構(gòu)成隨著抗原量的添加而添加，當(dāng)抗原抗體比例到達(dá)最正確時(shí)，量的添加而添加，當(dāng)抗原抗體比例到達(dá)最正確時(shí)，免疫復(fù)合物的量到達(dá)頂峰。免疫復(fù)合物的量到達(dá)頂峰。堅(jiān)持抗體過剩是免疫比濁法測定抗原含量的條件，堅(jiān)持抗體過剩是免疫比濁法測定抗原含量的條件，但抗體過剩必需適量。但抗體過剩必需適量。非待測抗原抗體特異結(jié)合生成的免疫復(fù)合物構(gòu)成的濁度。非待測抗原抗體特異結(jié)合生成的免疫復(fù)合物構(gòu)成的濁度。二偽濁度二偽濁度混濁、高血脂、長期保管或反復(fù)凍融、處置不當(dāng)?；鞚帷⒏哐?、長期保管或反復(fù)凍融、處置不當(dāng)?？贵w效價(jià)低于抗體效價(jià)低于1:201:20會(huì)添加偽濁度；會(huì)添加偽濁度；抗血清滅活處置；抗血清滅活處置；抗血清含有交叉反響性抗體；抗血清含有交叉反響性抗體；PEGPEG濃度過高引起血清中雜蛋白的非特異性共濃度過高引起血清中雜蛋白的非特異性共沉；沉；試劑污染如細(xì)菌、塵埃等和蛻變。