重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子的搖瓶發(fā)酵研究

1、西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)網(wǎng)絡(luò)版) 2004年12月，第2卷，第12期Science Journal of Northwest University Online Dec. 2004，Vol.2，No. 12重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子的搖瓶發(fā)酵研究馬 莉，白 泉，王驪麗，斯 琴，耿信篤（西北大學(xué) 現(xiàn)代分離科學(xué)研究所/現(xiàn)代分離科學(xué)陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710069）摘 要：為了優(yōu)化重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子搖瓶發(fā)酵工藝，利用搖瓶法選擇出最佳的rhGM-CSF的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：最佳條件為培養(yǎng)溫度32，初始pH值7.27.4，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，種子菌齡在OD600為1.

2、0左右時接種，并在對數(shù)生長前期0.50.8之間誘導(dǎo)4 h。在此優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，在搖瓶中使用M9培養(yǎng)基時，rhGM-CSF的表達(dá)量占菌體總蛋白的24.3%，OD600達(dá)5.35，說明構(gòu)建的rhGM-CSF工程菌發(fā)酵的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可為rhGM-CSF的大規(guī)模生產(chǎn)提供可靠的放大依據(jù)。關(guān) 鍵 詞：重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；大腸桿菌；搖瓶發(fā)酵中圖分類號：TQ920.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-274X(2004)0117-08人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor, hG

3、M-CSF)是一種重要的造血調(diào)控因子1，對各種原因尤其是癌癥患者化療后引起的白細(xì)胞減少癥有明顯的療效。由于天然人GM-CSF來源有限，產(chǎn)量甚微，不能滿足科研和臨床的需要，1985年Wong等人克隆了人GM-CSF cDNA，并實(shí)現(xiàn)了表達(dá)2,1993年張智清等人在國內(nèi)首次克隆了人GM-CSF cDNA，并在大腸桿菌中獲得表達(dá)3。近年來，許多科研人員也致力于這方面的研究，并取得了成功46。本文作者也克隆出了人GM-CSF cDNA，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá)。為了進(jìn)一步開發(fā)研究，實(shí)現(xiàn)rhGM-CSF的產(chǎn)業(yè)化，本文以提高其表達(dá)量和細(xì)胞產(chǎn)量為目標(biāo)，對重組大腸桿菌的搖瓶培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，確定出最佳生產(chǎn)重

4、組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的培養(yǎng)條件，為以后的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。 1 材料和方法1.1 材 料工程菌：菌種pDH/rhGM-CSF/DH5，由本所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。試劑：酵母粉（Yeast extract，OXOID公司產(chǎn)品），蛋白胨（Tryptone，OXOID公司產(chǎn)品），瓊脂糖（Agar powder，日本進(jìn)口分裝公司，上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠），氯化鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、氯化銨均為分析純。1.2 方 法1.2.1 一級種子的制備 選用LB培養(yǎng)基，其組成（g/L）：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化鈉10.0，氨芐青霉素0.1，pH調(diào)至7.0，

5、1.034105 Pa 高壓滅菌20 min。將種子接入其中后，于30，200 r/min的搖床_收稿日期：2004-06-02審 稿 人：申燁華，女，西北大學(xué)化學(xué)系副教授。內(nèi)培養(yǎng)過夜，OD600達(dá)1.0左右時即可進(jìn)行轉(zhuǎn)接。1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 選用M9培養(yǎng)基，其組成（g/L）：胰蛋白胨5.0，酵母粉5.0，葡萄糖10.0，Na2HPO4 12H2O 17.1，KH2PO4 3.0，NaCl 0.5，NH4Cl 1.0，氨芐青霉素0.1，pH調(diào)至7.2，1.034105 Pa 高壓滅菌20 min。1.2.3 菌體密度的測定 用721型分光光度計(jì)在600 nm波長下測定OD600值。1.2.4

6、 表達(dá)量的測定 取500L發(fā)酵液離心，棄上清液，向菌體中加樣品緩沖液。其組成為50 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8），50 mmol/L DTT，2% SDS，0.1% 溴酚藍(lán)和10% 甘油，然后攪拌均勻，沸水煮5min，離心。走SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色，用Cs-930雙波長掃描儀（Shimadzu）掃描測定rhGM-CSF表達(dá)量。2 結(jié)果與討論2.1 培養(yǎng)溫度對工程菌生長的影響微生物的生長和產(chǎn)物合成都是在各種酶催化下進(jìn)行的，溫度是保證酶活性的重要條件，因此在發(fā)酵過程中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)中選擇培養(yǎng)溫度27、30、32、35C進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果

7、見圖1。 27, 30, 32, 35圖1 培養(yǎng)溫度對重組大腸桿菌生長情況的影響Fig.1 Effect of culture temperature on the the growth of bacteria從圖1可看出，在27、30和32C培養(yǎng)時菌體密度均能達(dá)到5.00，但在32C時為最高。其原因是在較低溫度(如27C)進(jìn)行培養(yǎng)時細(xì)菌的生長代謝緩慢，菌體不能得到充分的增殖，而在較高溫度(如35C)進(jìn)行培養(yǎng)時，雖然生長迅速，但代謝加快，生產(chǎn)期提前，對葡萄糖的利用過多，排謝出大量的代謝副產(chǎn)物（如乙酸等），抑制了菌體的生長，因而菌體密度較低7。所以，以下實(shí)驗(yàn)均控制培養(yǎng)溫度在3032C。2.2 誘

8、導(dǎo)時機(jī)對工程菌生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響基因工程菌的兩階段培養(yǎng)法是為了在擴(kuò)大菌體密度的同時，盡可能提高工程菌的表達(dá)水平，因此誘導(dǎo)時機(jī)是至關(guān)重要的因素，在研究溫控誘導(dǎo)策略時應(yīng)先確定最佳的誘導(dǎo)時機(jī)。圖1顯示出所用大腸桿菌pDH/rhGM-CSF/DH5在32培養(yǎng)時的生長曲線。從圖1可見：13 h為延遲期，OD600剛到0.3左右；410 h為對數(shù)生長期，OD 600從0.5迅速增加到4.3；1114 h為穩(wěn)定期，OD 600變化不大；14 h以上為衰亡期，OD 600下降。以此為依據(jù)，在不同生長期(對數(shù)生長初期、中期和后期)，OD 600在0.3、0.5、0.8、1.0、2.0左右時分別升溫

9、至42 C誘導(dǎo)，誘導(dǎo)表達(dá)4 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。表1 誘導(dǎo)時機(jī)對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響Tab.1 Effects of induction time on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF誘導(dǎo)時OD 6000.35 0.52 0.81 1.10 2.05由表1可見：在菌體的對數(shù)生長前期（OD 600=0.52、0.81）進(jìn)行誘導(dǎo)可獲得較高的表達(dá)量，在OD 600=0.35時誘導(dǎo)，由于菌體沒有充分增殖就擔(dān)負(fù)起表達(dá)外源基因產(chǎn)物和分裂后代的雙重任務(wù)，勢必難以獲得較高的菌體產(chǎn)量，比OD 600大約0.5時誘導(dǎo)的產(chǎn)量低；當(dāng)在

10、對數(shù)生長中后期（OD 600=1.10、2.05）進(jìn)行誘導(dǎo)時，此時菌體雖充分增殖，但由于生存環(huán)境已經(jīng)惡化，pH下降，部分營養(yǎng)物質(zhì)減少甚至缺乏，使得工程菌的活力衰弱，不能給基因表達(dá)提供大量活力旺盛的細(xì)胞。因此，最好選擇在OD 600為0.50.8之間升溫誘導(dǎo)。菌體密度OD 6003.652 5.191 5.245 4.783 4.232rhGM-CSF 表達(dá)量/%16.4 20.8 20.4 13.2 10.12.3 誘導(dǎo)表達(dá)時間對工程菌生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響采用兩階段培養(yǎng)法，在菌體生長到OD 600 0.5時升溫42誘導(dǎo)，考察表達(dá)時間對菌體生長和表達(dá)的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。OD 60

11、0， rhGM-CSF表達(dá)量圖2 誘導(dǎo)表達(dá)時間對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響Fig.2 Effects of expression time on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF由圖2可看出，誘導(dǎo)45 h之后，菌體密度與表達(dá)量均達(dá)最大值。這可能是因?yàn)椋赫T導(dǎo)后第23 h，細(xì)菌培養(yǎng)物仍處于對數(shù)生長期，菌液密度較小，細(xì)菌培養(yǎng)物還在不斷繁殖，故此階段菌體密度和表達(dá)量都處于上升期；誘導(dǎo)45 h后，細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)生長后期，培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度趨于穩(wěn)定，表達(dá)也達(dá)最高；繼續(xù)誘導(dǎo)，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不足，生存環(huán)境已經(jīng)惡化，菌體密度有所下降，表達(dá)量

12、下降幅度較大。2.4 pH值對工程菌生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響培養(yǎng)基的pH值影響培養(yǎng)基中某些物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的解離，從而影響微生物對營養(yǎng)成分的吸收和代謝。因此，各種微生物都有最適生長的pH值范圍，超出這個范圍，菌體的生長就會受到影響甚至停止。在工程菌的搖瓶發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的初始pH值是一個重要參數(shù)，它對于細(xì)胞的正常生長和外源基因的高效表達(dá)都有影響8。本實(shí)驗(yàn)中采用初始pH值分別為6.67.6的培養(yǎng)基，考察對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。OD600， rhGM-CSF表達(dá)量圖3 培養(yǎng)基初始pH值對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響Fig.3 Effects of

13、 initial pH of culture media on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF從圖3中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基初始pH值對工程菌生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響趨勢基本一致，均有一個最優(yōu)值，當(dāng)pH為7.2時，rhGM-CSF的表達(dá)處于最佳，當(dāng)pH在7.4時的菌體密度最高，表達(dá)量稍稍次之。一般情況下，E.coli表達(dá)外源蛋白的最適pH為6.06.59，而在此優(yōu)化的初始pH在7.2或7.4。這是因?yàn)閾u瓶發(fā)酵過程中，不斷產(chǎn)生乙酸等代謝廢物，使得培養(yǎng)基的pH下降。因此，培養(yǎng)基的初始pH應(yīng)控制在7.27.4。2.5 接種量對工程菌生

14、長和rhGM-CSF表達(dá)的影響接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接入適量的種子，由于種子液中含有大量的體外水解酶類，有利于對基質(zhì)的利用，可以縮短生長的延遲期，并且使生產(chǎn)菌迅速占據(jù)了整個培養(yǎng)環(huán)境，可減少雜菌生長的機(jī)會。但是，如果接種量過多，往往使菌體生長過快，一方面會使培養(yǎng)液粘度增加，造成溶解氧不足，影響產(chǎn)物的合成，另一方面會加劇工程菌質(zhì)粒的丟失，使菌體表達(dá)外源蛋白的能力下降10。同樣，如果接種量過小，就會使發(fā)酵周期延長，不利于外源基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中采用不同的比例接種，考察對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。表2 接種量對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響Tab.2 E

15、ffects of inoculum volumes on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF接種量/%1234從表2可見，無論從發(fā)酵菌體量還是從rhGM-CSF表達(dá)量上看，當(dāng)接種量為3時兩者均為最高，因此采用適當(dāng)?shù)慕臃N量有利于重組菌的生長和外源基因的表達(dá)，以后實(shí)驗(yàn)中采用3的接種量。 OD600 3.55 4.27 5.34 5.12 4.87 表達(dá)量/% 15.3 17.9 21.6 19.3 16.92.6 搖床轉(zhuǎn)速對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響不同搖床轉(zhuǎn)速對工程菌生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響如表3所示。表3 搖床

16、轉(zhuǎn)速對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響Tab.3 Effects of rotational speed on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF轉(zhuǎn)速/rmin-1140160180200220表3結(jié)果顯示，隨著轉(zhuǎn)速的提高，rhGM-CSF菌體密度也提高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為220 r/min時，菌體密度最高，而菌體表達(dá)量先增加后降低，轉(zhuǎn)速為200 r/min時表達(dá)最好。這說明轉(zhuǎn)速越高，旋轉(zhuǎn)時發(fā)酵液與空氣接觸面積越大，氧氣傳質(zhì)越快，供氧量能夠滿足菌體生長的要求11；當(dāng)轉(zhuǎn)速低時供氧量不足，菌體生長緩慢，rhGM-CSF表達(dá)量較低，因此可以提

17、高搖床轉(zhuǎn)速來提高外源蛋白的產(chǎn)量。通常生產(chǎn)中需要考慮的是rhGM-CSF的產(chǎn)量，因此需綜合考慮菌體密度和rhGM-CSF表達(dá)量這兩個因素作為優(yōu)化指標(biāo)。OD600與細(xì)胞干重成正比，所以用OD600乘以rhGM-CSF表達(dá)量的數(shù)值，表征其產(chǎn)量。200 r/min和220 r/min時，該數(shù)值分別為115.8和111.9，可見200 r/min優(yōu)于220r/min，所以搖床轉(zhuǎn)速選定在200 r/min左右。 OD600 4.235 4.764 5.016 5.125 5.205 rhGM-CSF表達(dá)量/% 16.1 18.7 20.4 22.6 21.52.7 種子菌齡對工程菌生長和rhGM-CSF表

18、達(dá)的影響種子液質(zhì)量的優(yōu)劣對發(fā)酵生產(chǎn)起著關(guān)鍵的作用，若將過于年輕的種子接入搖瓶中，往往會出現(xiàn)前期生長緩慢、整個發(fā)酵過程周期延長、產(chǎn)物形成的時間推遲等現(xiàn)象，甚至?xí)蚓w量過少而在發(fā)酵中結(jié)球，造成異常發(fā)酵。然而，菌齡過老，又會引起菌種生產(chǎn)能力的下降。因此，我們在實(shí)驗(yàn)中將不同菌齡的種子液按3%的接種量接于M9培養(yǎng)基中，培養(yǎng)OD600至 0.5左右，升溫至42誘導(dǎo)表達(dá)4 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。 5表4 種子菌齡對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響Tab.4 Effects of inoculum age on the growth of bacteria and expression of rhGM-C

19、SF種子菌齡OD6000.5 1.0 1.5 2.0終止OD600 4.689 5.132 4.725 4.489rhGM-CSF表達(dá)量/%16.1 23.8 20.4 18.5由表4可見，種子液OD600在0.52.0時，隨種子液濃度增高，發(fā)酵液的終止OD600先升后降，而rhGM-CSF的表達(dá)量亦有一最佳值。綜合考慮細(xì)胞密度和rhGM-CSF的表達(dá)量，選擇種子菌齡的OD600為1.0左右時較為合適。3 結(jié) 論通過對工程菌pDH/rhGM-CSF/DH5搖瓶發(fā)酵工藝條件的研究，確定出搖瓶發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度32；初始pH值7.27.4；搖床轉(zhuǎn)速200 r/min；種子菌齡在OD600

20、為1.0左右時進(jìn)行接種；培養(yǎng)至OD600 0.50.8，升溫至42誘導(dǎo)表達(dá)4 h。用選定的優(yōu)化條件，發(fā)酵3批，結(jié)果見表5，電泳結(jié)果見圖4，rhGM-CSF的表達(dá)量平均24.3%，平均OD600可達(dá)5.35。由此可見，用我們構(gòu)建的工程菌發(fā)酵的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可為rhGM-CSF的大規(guī)模生產(chǎn)提供可靠的放大依據(jù)。表5 優(yōu)化條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 The experimental results under optimal conditions 實(shí)驗(yàn)批次1 2 3 平均OD600 5.445 5.238 5.369 5.3500.112rhGM-CSF表達(dá)量/%24.2 24.7 23.9 2

21、4.30.4rhGM-CSF圖4 搖瓶優(yōu)化條件下SDS-PAGE圖Fig.4 The SDS-PAGE under optimal conditions in shaking flask參考文獻(xiàn)：1 METALF D. The granulocyte-macrophage colony stimulating factorsJ. Science，1985，229：16-22.2 WONG G G，WITEK J S. Human GM-CSF：molecular cloning of the complementory DNA and purification of the natural r

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25、aration Science, Northwest University, Xian 710069, China)Absract: Fermentation technology of recombination E.coli expressing human granulocyte-macrophage colony stimulating factor(hGM-CSF) with shaking flask was optimized for rhGM-CSF. The experimental results show that the optimum conditions are: