血清清蛋白γ球蛋白分離純化與純鑒定

1、血清清蛋白、-球蛋白分離、純化與純度鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握凝膠層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法2. 掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法3.掌握離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法4.掌握鹽析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法5.學(xué)習(xí)柱層析技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)的分離和純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)及其生物學(xué)功能的重要手段。不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及等電點(diǎn)等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分離純化各種蛋白質(zhì)。（一）粗提原理-鹽析法1.鹽析法：在蛋白質(zhì)溶液中,加入無(wú)機(jī)鹽至一定濃度， 或達(dá)飽和狀態(tài)，可使蛋白質(zhì)在水中溶解度降低，從而分離出來。2.水化膜減弱、消失。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與

2、水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱乃至消失。3.蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和。中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。4.由于血清中各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小、所帶電荷的多少和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而達(dá)到分離的目的。（二）脫鹽原理-凝膠層析1.鹽析分離的蛋白質(zhì)溶液中含有大量無(wú)機(jī)鹽，必須先脫鹽后才能進(jìn)一步純化。2.凝膠層析法主要是根據(jù)混合物中各種物質(zhì)分子大小的不同而將其分離的技術(shù)。（三）純化原理-離子交換層析離子交換層析是指流動(dòng)相中的離子和固

3、定相上的離子進(jìn)行可逆的交換，利用化合物的電荷性質(zhì)及電荷量不同進(jìn)行分離。（四）純度鑒定-醋酸纖維素薄膜電泳血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，一般都低于pH7.4。它們?cè)趐H8.6的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白（Albumin)、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白5條區(qū)帶。三、材料與方法：（一）實(shí)驗(yàn)材料1.樣品：人混合血清2.試劑：葡聚糖凝膠G-25(Sephadex G-25)層析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素離子交換層析柱、各不同濃度的pH6.5醋酸銨緩

4、沖溶液、pH8.6巴比妥緩沖溶液、氨基黑10B染色液、20%磺基水楊酸溶液、飽和硫酸銨溶液、1%BaCl2溶液、漂洗液器材：層析柱、電泳儀、電泳槽、離心機(jī)、離心管、黑色反應(yīng)板等（二）實(shí)驗(yàn)方法取血清1.0ml，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻室溫放置10min，4000r/min離心10min1.實(shí)驗(yàn)步驟鹽析沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml溶解上清液（含清蛋白、少量球蛋白和球蛋白）過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm）過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm）用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,流出液量約1ml用1ml 0.02m

5、ol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,流出液量約1ml凝膠柱層析除鹽繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液(2ml)洗脫繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液(2ml)洗脫磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液15d收集含有蛋白質(zhì)的峰液15d繼續(xù)用2ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液洗滌 繼續(xù)用0.02mol/L NH4AC緩沖液洗滌約2ml BaCl2檢測(cè)至SO42-陰性BaCl2檢測(cè)至SO42-陰性用23ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液再生平衡用23ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液再生平衡離子交換柱層析純

6、化除鹽后收集的球蛋白除鹽后收集的清蛋白 過DEAE-纖維素層析柱（1.0×6cm）過DEAE-纖維素層析柱（1.0×6cm）用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液(3ml)洗脫，流出液量約1ml開始檢測(cè)蛋白質(zhì)離子交換柱層析純化用1ml 0.06mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,用約5mL 0.06mol/L NH4AC緩沖液流洗，除去球蛋白和球蛋白磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液每管10d，連續(xù)收集3管用0.3mol/L NH4AC緩沖液(約3ml)洗脫，流出液量約2ml開始檢

7、測(cè)蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)DEAE-纖維素柱不用再生，可直接用于純化清蛋白收集含有清蛋白的洗脫液每管10d，連續(xù)收集2管取濃度最高的1管作純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）離子交換柱再生和蛋白純度鑒定DEAE-纖維素柱先用6ml l.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4AC溶液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液流洗再生平衡2管均作純度鑒定(醋酸纖維素薄膜電泳法)用鑷子取出薄膜，吸去多余的緩沖液，粗面朝上置于載玻片上，在薄膜一段處用鉛筆標(biāo)記點(diǎn)樣線準(zhǔn)備醋酸纖維素薄膜電泳點(diǎn)樣用玻片沾取樣品，垂直落下于點(diǎn)樣線并迅速提起將已點(diǎn)好樣品的薄膜架在電泳槽上，點(diǎn)樣面朝下，點(diǎn)樣端

8、置陰極，輕輕拉平薄膜，蓋上電泳槽蓋，打開電源，開始電泳，時(shí)間約為50min電泳電泳完畢后用鑷子取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min染色漂洗從染色液中取出已染好的薄膜條投入漂洗液中，反復(fù)漂洗3-4次，直至背景無(wú)色為止將漂洗干凈的薄膜完全干燥后，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并拍照記錄干燥2.注意事項(xiàng)ü 上樣時(shí)，滴管應(yīng)沿柱上端內(nèi)壁加入樣品，動(dòng)作應(yīng)輕、慢，勿將柱床沖起。流洗平衡時(shí)亦應(yīng)如此。ü 洗脫時(shí)應(yīng)注意及時(shí)收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失，并注意層析柱不要流干，進(jìn)入空氣。ü 切勿將檢測(cè)蛋白質(zhì)的磺基水楊酸與檢查SO42-的BaCl2混淆，因二者與相應(yīng)物質(zhì)生成的沉淀均為白色。四、結(jié)果與

9、討論：（一）實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象1.鹽析1）加入飽和硫酸銨溶液后，血清變成乳黃白色渾濁溶液。如圖3-12）離心后出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象，上清液呈黃色透明，沉淀呈乳黃白色。如圖3-2圖3-1圖3-2 2.凝膠柱層析除鹽1）將沉淀溶液加入過葡聚糖凝膠G-25層析柱后，層析柱內(nèi)無(wú)色透明溶液變渾 濁，之后，隨著溶液的流出（流速緩慢），層析柱上層液體逐漸變清澈呈黃色。2）經(jīng)過緩沖液的洗脫后，將過葡聚糖凝膠G-25層析柱內(nèi)溶液滴入加有磺基水楊酸的黑色反應(yīng)板空中，檢測(cè)蛋白質(zhì)，出現(xiàn)白色沉淀。見右圖3-3紅框圖3-3（紅框內(nèi)為磺基水楊酸，藍(lán)圈內(nèi)為BaCl2）3）接著，收集含有蛋白質(zhì)的峰液（球蛋白）呈 無(wú)色透明。 4）用BaCl

10、2檢測(cè)SO42-沒有沉淀（即為陰性），進(jìn)行再生平衡。見上圖3-3藍(lán)圈5）將上清液加入過葡聚糖凝膠G-25層析柱中，層析柱內(nèi)無(wú)色透明溶液變成淡黃色透明溶液。6）用磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)，同樣出現(xiàn)白色沉淀。見圖3-4 7）接著，收集含有蛋白質(zhì)的峰液（清蛋白）呈淡淡的黃色透明狀。圖3-48）用BaCl2檢測(cè)沒有沉淀（即為陰性），進(jìn)行再生平衡。3離子交換柱層析純化1）收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液3管（球蛋白）呈無(wú)色透明。2）用磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)，未出現(xiàn)明顯白色沉淀。3）連續(xù)收集2管含有清蛋白的洗脫液，均為很淡很淡的黃色透明溶液，幾乎接近無(wú)色。4醋酸纖維素薄膜電泳1）電泳結(jié)束后，醋酸纖維素薄膜沒有出現(xiàn)現(xiàn)象。2

11、）將薄膜從染色液中取出，薄膜染上深藍(lán)色。3）將薄膜漂洗干洗后，深藍(lán)色消失。4）取出薄膜后，具體情況如下圖 -球蛋白-球蛋白-球蛋白清蛋白 由上圖可見，本次實(shí)驗(yàn)成功顯現(xiàn)出了清，球蛋白的條帶，然而顏色過淺，色帶過于模糊，與下圖另一小組所做的結(jié)果形成了鮮明的對(duì)比。分析討論Ø 在脫鹽步驟中，收集球蛋白、清蛋白時(shí)機(jī)太晚，雖然是在磺基水楊酸檢測(cè)出蛋白質(zhì)后才收集的，很可能前面已經(jīng)流走大量蛋白質(zhì)了Ø 在純化步驟中，純化球蛋白時(shí)，因?yàn)榇中?，未等層析柱上的球蛋白溶液下降到凝膠床便加0.02mol/L的NH4Ac，對(duì)球蛋白溶液造成了稀釋，加之收集的時(shí)候太過心切，且磺基水楊酸檢測(cè)一直無(wú)反應(yīng)，很可能

12、錯(cuò)過了球蛋白流出的峰期，沒收集到足夠的球蛋白?；仡櫡此技兓虻鞍椎臅r(shí)候，是利用清蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白等電點(diǎn)的不同，令前三者吸附在離子交換柱上，用0.02mol/L的NH4Ac洗出球蛋白，再往離子交換柱加入除鹽后的清蛋白，利用清蛋白所帶電荷多，球蛋白、球蛋白所帶電荷少，所以加入0.06mol/L的NH4Ac是為了洗脫球蛋白、球蛋白，最后加入3mL0.3mol/L的NH4Ac是為了把最后留在離子交換柱上的清蛋白洗脫出來。因而每個(gè)步驟的時(shí)間掌控，液體收集的滴數(shù)，所加試劑的量都會(huì)非常敏感地影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因而我們?nèi)孕杓訌?qiáng)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)操作訓(xùn)練，做好預(yù)習(xí)工作，事先分工并模擬實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。附：思考題1.硫酸銨

13、鹽析一步,為什么是1ml血清加0.8ml飽和硫酸銨?調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而達(dá)到分離的目的。1.0ml血清加0.8ml飽和硫酸銨的目的是將飽和硫酸銨稀釋為半飽和硫酸銨，在此濃度下清蛋白不沉淀，成為上清液，球蛋白沉淀，這樣就可以將兩者分離。綜上所述，1.0ml血清加0.8ml飽和硫酸銨，鹽析效果會(huì)比較好。2.為什么實(shí)驗(yàn)中DEAE纖維素柱分離-球蛋白后不用再生,可直接用于純化清蛋白？因?yàn)镈EAE纖維素是一種陰離子交換劑，帶正電荷，而-球蛋白帶正電荷，能夠不被吸附而從層析柱流出，而且?guī)ж?fù)電荷的清蛋白能夠與DEAE纖維素進(jìn)行陰離子交換而結(jié)合，只要提高醋酸銨緩沖液的濃度就能夠洗脫出清蛋白。3.應(yīng)用醋酸纖維素薄膜電泳