巴斯德畢赤酵母新型分泌表達載體構(gòu)建

1、 文章編號 :10083464(2003 01003704巴斯德畢赤酵母新型分泌表達載體構(gòu)建韋宇拓 , 甘鳳瓊 , 蘇華波 , 趙穎怡 , 汪嶸 , 黃日波(廣西大學 生物技術(shù)實驗中心 , 廣西 南寧 530005摘要 :巴斯德畢赤酵母分泌表達載體 pP I C I NU 是利用來源于克魯維酵母 (K luy vero m y ces m arx ianus 的菊 粉 酶 基 因 信 號 肽 DNA 序 列 (ISP 構(gòu) 建 的。 表 達 實 驗 結(jié) 果 表 明 , 帶 有 分 泌 表 達 載 體 pP I C I NU 的 -1, 3-1, 4葡 聚 糖 酶 基 因 重 組 菌 , 具 有

2、與 帶 有 表 達 載 體 pP I C 9K (帶 有 因 子 信 號 肽 的 -1, 3-1, 4葡聚糖酶基因重組菌相同的分泌效率 。 關(guān)鍵詞 :巴斯德畢赤酵母 ; 克魯維酵母菊粉酶基因信號肽 ; 分泌表達 ; 因子信號肽中圖分類號 :Q 782 文獻標識碼 :ACon struction of a P ich ia p astorisYu tuo , GAN Feng qi ong , SU H ua bo ,ZHAO Y ing yi , W AN G Rong , HUAN G R i bo(B i o techno logy R esearch Cen ter , Guangx i

3、 U n iversity , N ann ing 530005, Ch ina Abstract :T he secreting exp ressi on vecto r , pP I C I NU con tain ing inu linase signal pep tide (ISP from K luy vero m y ces s m a rx ianu , of P ich ia p astoris w as con structed . T he exp ressi on resu lts show ed that the secreti on efficiency of the

4、 beta1, 31, 4glucanase of recom b inan t P . p astoris con tain ing p P I C I NU w as as h igh as that of recom b inan t P . p astoris harbo ring pP I C I 9K carrying facto r p rep ro p ep tide .Key wards :P ich ia p astori ; signal pep tides of K luy vero m y ces s m a rx ianu inu linase ; secretin

5、g ex 2p ressi on ; -facto r p rep ro pep tide Bong 等研究中發(fā)現(xiàn)在克魯維酵母 (K luy vero m y ces m a rx ianus 中 , 大部分菊粉酶能被分泌到胞外 , 將其先導肽用在釀酒酵母中能促進多種外源蛋白分泌到胞外 , 分泌效率高于常用的 因子信號肽 1。 因 此 , 克魯維酵母菊粉酶信號肽可能是一種能引導外源蛋白有效分泌的信號肽 , 但將其信號肽用于促進 外源蛋白在巴斯德畢赤酵母 (P ich ia p astoris 中分泌表達國內(nèi)外尚未有相關(guān)報道 。我們曾利用 因子 信號肽在巴斯德畢赤酵母中成功使 1, 31, 4葡

6、聚糖酶表達并分泌到胞外 2, 本研究利用克魯維酵 母菊粉酶基因的信號肽序列構(gòu)建新型巴斯德畢赤酵母分泌型表達載體 , 并表達 1, 31, 4葡聚糖酶 , 由此比較 因子信號肽和菊粉酶信號肽在巴斯德畢赤酵母中的分泌效率 , 為巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng) 尋找到一種新的能高效分泌外源蛋白的信號肽 。第 22卷第 1期 V o l 122, N o 11廣 西 農(nóng) 業(yè) 生 物 科 學 Journal of Guangxi A gric . and B i o l . Science 2003年 3月 M ar . , 2003收稿日期 :20020829基金項目 :國家高技術(shù) 863資助項目 (2001

7、AA 214171作者簡介 :韋宇拓 (1971 , 男 , 廣西貴港人 , 廣西大學博士研究生 ; 黃日波為通訊聯(lián)系人 。 1 材料和方法111材料浸麻芽孢桿菌 (B acillus m acerans 1164 購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心 。 巴斯德畢赤 酵母表達系統(tǒng)試劑盒 (M u lti -Cop y P ich ia Exp ressi on K it 購自 Invitrogen 公司 。 大腸桿菌菌株 DH 5由本 實 驗 室 保 存 。 寡 聚 核 苷 酸 由 Sangon 生 物 公 司 合 成 。 核 酸 酶 購 自 大 連 T akara 。 地 衣 多 糖 (

8、lichenan 購自 Sigm a 公司 。 -1, 3-1, 4葡聚糖酶雜合基因 bg l HAM 的擴增在本實驗室進行 。 112方法11211 DNA 的操作 、 重組 、 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化參照文獻 3。11212分泌表達載體 pP I C I NU 的構(gòu)建參照文獻 1,設計并合成菊粉酶 inu linase 信號肽 DNA 序 列 (簡稱 ISP , 在 ISP 序列兩端設計 B am H I 和 E co R I 兩個酶切位點利于連接到載體 。將 ISP 片段連 接到巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)無先導肽的表達載體 pP I C 315K 的多克隆位點上 , 并進行測序分析 , 正確 的重組

9、子即為分泌表達載體 p P I C I NU 。圖 1 I SP 信號肽序列的核酸序列F ig 11 Nucleotide sequences of i nuli nase signal peptide (I SP 11213 酵母分泌表達質(zhì)粒 pP I C I NU -HAM 和 p P I C 9K -HAM 的構(gòu)建同文獻 2,根據(jù) Gene B ank 中 -葡聚糖酶基因的已知序列設計引物 , 以浸麻芽孢桿菌總 DNA 為模板 , PCR 擴增 -葡聚糖酶雜 合基因 bg l HAM 。 引物劃線為部分 E co R I 識別位點 。上游引物 :5 -GGCGGA TCGTTTTTTGA

10、ACCTTTTAA CA GCTTTAA TCCGA GTACA -3下游引物 :5 -GCTGCAA TCA TA TTAA TTG -3PCR 產(chǎn)物經(jīng) E co R I 消化后分別連接到構(gòu)建好的分泌表達載體 pP I C I NU 和試劑盒本身提供的分 泌 表 達 載 體 p P I C 9K 先 導 肽 的 下 游 , 重 組 質(zhì) 粒 分 別 轉(zhuǎn) 化 DH 5感 受 態(tài) 細 胞 , 以 含 氨 芐 青 霉 素 (100g mL 的 LB 平板篩選轉(zhuǎn)化子 , 并經(jīng)酶切鑒定 , 將獲得重組質(zhì)粒 , 分別命名為 pP I C I NU -HAM 和 p P I C 9K -HAM 。11214

11、巴斯德畢赤酵母的培養(yǎng) 、轉(zhuǎn)化 、高拷貝菌株篩選和鑒定及重組菌的表達均參照 Invitrogen 公 司產(chǎn)品說明書 :M u lti -Cop y P ich ia Exp ressi on K it In structi on M anual 。11215重組菌的誘導表達分別取重組酵母單菌落 P ich ia p astoris pP I C I NU -HAM 、 P ich ia p as 2toris pP I C 9K -HAM , 以空載體 p P I C I NU 和 p P I C 9K 轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母菌株 K M 71的重組酵母菌 作 對照。 重組酵母菌的培養(yǎng)及誘導表達于

12、10mL BM GY 培養(yǎng)基中 1%酵母提取物 , 2%蛋白胨 , 1134%YNB , 0100004%B i o tin , 1%甘油 (體 積 比 , 30 劇 烈 振 搖 使 細 胞 生 長 至 飽 和 狀 態(tài) (A 600=1020 , 離心收集菌體 , 加入 10mL 誘導培養(yǎng)基 BMM Y (用 015%甲醇代替 BM GY 中的甘 油 , 30下繼續(xù)誘導培養(yǎng) 10d , 每 12h 取樣及補加甲醇 , 維持甲醇濃度為 015%。11216重組 -葡聚糖酶酶活性測定根據(jù)文獻 4,-葡聚糖酶的活力可通過檢測 lichenan 經(jīng) -葡 聚糖酶作用后產(chǎn)生的還原糖的量來測定 。 1U

13、定義為每分鐘產(chǎn)生 1m o l 的還原糖 (以葡萄糖為參比 所 需要的酶量 。還原糖量的測定采用 3, 5一二硝基水楊酸 (DN S 比色法 5(測三個重復樣取平均值 。 分泌 -葡聚糖酶活力的測定 :取 1mL 發(fā)酵液 8000r m in 離心 5m in 后取上清測定 -葡聚糖酶的活 83廣 西 農(nóng) 業(yè) 生 物 科 學 第 22卷 力為分泌到胞外的酶活 。胞內(nèi)酶活的測定 :菌體按文獻 3加酵母破胞緩沖液至 1mL , 用 lyticase 破 胞后測定 -葡聚糖酶的活力為胞內(nèi)的酶活 。11217表達產(chǎn)物的 SD S PA GE 分析重組酵母 30誘導培養(yǎng) , 測定發(fā)酵液酶 , 酶活力最高

14、時取 1mL發(fā)酵液離心去除菌體 , 取 3L 上清液進行 SD S PA GE 分析 3。2結(jié)果分析211分泌表達載體將合成 ISP 的兩條寡聚核苷酸退火后 , 用 B am H I 和 E co R I 消化后插入表達載體 pP I C 315K 的多克 隆位點 , 篩選重組子并進行測序分析 , 結(jié)果證明 ISP 片斷已正確插入質(zhì)粒 pP I C 315K 即得到新的分泌表 達載體 pP I C I NU 。將擴增得到的 -葡聚糖酶雜合基因 bg l HAM 用 E co R I 消化后分別連接到用 E co R I 消化的載體 p P I C I NU 和 pP I C 9K , 連接產(chǎn)物

15、轉(zhuǎn)化 DH 5感受態(tài)細胞 , 提取質(zhì)粒經(jīng)酶切 、電泳鑒定獲得 正向的重組質(zhì)粒篩選正確方向的克隆 , 分別得到重組質(zhì)粒 pP I C I NU -HAM 和 pP I C 9K -HAM 。 212巴斯德畢赤酵母的 -葡聚糖酶表達菌株將構(gòu)建好的 -葡聚糖酶表達載體 p P I C I NU -和 p I C 9K YPD 平板篩 選高拷貝的重組菌 , 分別獲得抗 G (2m , 分 別獲得三株 -HAM 1, 2, 3和 K M 71 I NU -HAM 1, 2, 3。 213 -將 篩 選 -葡 聚 糖 酶 高 產(chǎn) 菌 株 以 導 入 空 白 載 體 的 重 組 菌 K M 71 pP I

16、C I NU 和K M 71 pP I C 9K 分別作為對照 (CK , 誘導培養(yǎng)在發(fā)酵液的 -葡聚糖酶活力最高時 , 同時取菌體破胞 后測定胞內(nèi)的 -葡聚糖酶的活力 , 與發(fā)酵液的酶活相比就為先導肽的分泌效率 , 結(jié)果如表 1所示 , 信 號肽平均分泌百分比 ISP 為 9816%, 因子為 9813%。表 1 重組巴斯德畢赤酵母菌胞外和胞內(nèi) -葡聚糖酶活的比較 Table 1 The bet a -1, 3-1, 4glucanase avtiv ity of reco m bi nan t P ich ia p astoris酵母菌株Yeaststrains 胞外酶活力 A ctivi

17、ty of exoenzym e U mL -1胞內(nèi)酶活力 A ctivity of endoenzym e U mL 分泌百分比 Percentage of secreti on %酵母菌株 Yeast strains 胞外酶活力 A ctivity of exoenzym e U mL -1胞內(nèi)酶活力 A ctivity of endoenzym e U mL 分泌百分比 Percentage of secreti on%K M 71 pP I C I NU HAM 1 326144119818K M 71 pP I C 9K HAM 1 296124159815K M 71 pP I C

18、 I NU -HAM 2 298183199817K M 71 pP I C 9K HAM 2 28713419981371 3 25313413981371 93 243114199810平均 A verage 292184119816平均 A verage 275154189813K M 71 pP I C I NU (CK 00K M 71 pP I C 9K (CK 00結(jié)果表明所構(gòu)建的分泌表達載體 pP I C I NU 和 pP I C 9K 都能夠很好地分泌表達 -葡聚糖 , 而空白 對照 -葡聚糖酶活檢測不到 。胞外和胞內(nèi)酶活的比較表明分泌表達載體 pP I C I NU 分泌

19、效率不低于以 使用 因子信號肽的分泌表達載體 p P I C 9K 。214分泌表達產(chǎn)物的 S D S -PAGE 分析將重組菌誘導表達到胞外酶活最高時 , 取發(fā)酵液進行 SD S -PA GE 分析 , 結(jié)果 (圖 2 表明 :因 子信號肽和 ISP 信號肽都能使 -葡聚糖酶雜合基因 bg l HAM 在巴斯德畢赤酵母中表達并分泌到發(fā)酵 液 , 兩者的分子量相同與由基因序列推測所得 24KD 理論分子量基本一致 , 這表明 -葡聚糖酶雜合基 因 bg l HAM 不僅得到了表達 、 分泌 , 而且 (因子信號肽和 ISP 信號肽都能夠被正切切割 。93第 1期 韋宇拓等 :巴斯德畢赤酵母新型

20、分泌表達載體構(gòu)建 3討論圖 2 S D S -PAGE 12 expression by S D S -PAGE 1. 菌株 K M 71 pP I C 9k 的總分泌蛋白 ; 2. 菌株 K M 71 pP I C 9k -HAM 1的總分泌蛋 白 ; 3. 菌株 K M 71 pP I C I 的總分泌蛋白 ; 4. 菌 株 K M 71 pP I C I NU -HAM 1的總分泌蛋白 ; 5. 蛋白質(zhì)標準 1. To tal secreted p ro teins of K M 71 pP I C 9k ; 2. To tal secreted p ro teins of K M 71

21、 pP I C 9k -HAM 1; 3. To tal secreted p ro teins of K M 71 pP I C I NU ; 4. To tal secreted p ro teins ofK M 71 pP I C I NU HAM 1; 5. P ro tein m arker .目前 , 有多種先導肽成功地應用于巴斯德畢赤酵母的分泌表達 , 最常用的是來源于釀酒酵母的 因子信號肽和巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶信號肽 , 其中以 因子信號肽最為成功 , 也是使用最廣泛的先導肽 , 它能促進多種異源蛋白在巴斯德畢赤酵母中的分泌表達 6。 然而 , 信號肽對不同的異源蛋白分泌效

22、率會有很大的差異 , 有些外源蛋白甚至不能被 因子和酸性磷酸酶信號肽分泌 , 需要新的信號肽才能使外源蛋白分泌 7。 有些信號肽的分泌效率受胞內(nèi)m RNA 的積累水平 、培養(yǎng)條件和誘導的影響 8。 因此尋找更 多有效的信號肽 , 比較不同信號肽對異源蛋白的分泌效率具有重要的意義 。本文研究利用菊粉酶的信號肽序列來構(gòu)建巴斯德畢赤酵母分泌載體并表達了 -葡聚糖酶 , 結(jié)果表明 ISP 胞 外 , p P I C 9K 的 L ys -A rg , 泌 , 表達產(chǎn)物的信號肽能被內(nèi)切蛋白酶 (endop ro tease 正確識別并切割 9。 此外 , ISP 信號肽序列僅為 25個氨基酸遠小于 因子

23、的 75個氨基酸 , 這有利于減少表達載體的分子量 , 提高整合到宿主染色體上外源基因表達盒的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄效率 。但是 I NU 能否促進其它蛋白的分泌 , 還需要作進一步的研究 。 參考文獻 :1 CHUN G B H , NAM S W , K I M B M 1Comm unication to the editor highly efficient secretion of heterologous p roteins from S accharo m y cescerev isiae using inulinase signalpep tides J 1B i o techno lo

24、gyandbi oengineering , 1996, 49: 47347912蘇華波 , 韋宇拓 , 黃鯤 , 等 1-葡聚糖酶雜合酶基因 bglHAM 的克隆及在 P 1p astoris 中表達 J 1廣西大學學報 (自然科學版 , 2002, 27:101313 SAM BROO K J , RU SSELL D W . M o lecular C loning -A L abo rato ry M anual (th ird editi on M . C lod Sp ringH arbo r , N ew Yo rk :By C lod Sp ring H arbo L abo rato ry P ress 1200114 AND ER SON M A , STON E B A . A new substrate fo r investigating the specificity of -lucanhydro lates J 1FEBS L etters , 1975, 52:20220715張龍翔 , 張庭芳 , 李令媛 . 生化實驗方法和技術(shù) (第 2版 M 1北京 :高等教育出版社 , 199716 CER EGH I NO J