春夏兩季楊梅樹葉部精油成分及抗氧化活性比較研究

1、春夏兩季楊梅樹葉部精油成分及抗氧化活性比較研究(1)                   作者：鐘瑞敏，張振明，肖仔君，王羽梅，曾慶孝【摘要】  目的探討不同季節(jié)烏楊梅葉部精油成分與抗氧化活性的差異。方法采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合Kovats保留指數(shù)對比法分析了春夏兩季烏楊梅鮮葉精油的成分， 運(yùn)用DPPH自由基清除法、-胡蘿卜素漂白法和硫代巴比妥酸法對精油抗氧化活性進(jìn)行了綜合對比分析。結(jié)果春季精油產(chǎn)量(0.

2、13%)高于夏季(0.05%)，春季精油成分以倍半萜烯含氧衍生物為主(占52.69%)，夏季精油則以倍半萜烯為主(占70.04%)，其中5-羥基白菖烯是變化差異最為顯著的特征成分。春季精油表現(xiàn)出優(yōu)良的脂質(zhì)抗氧化和清除DPPH自由基活性，而夏季精油僅表現(xiàn)出有限的脂質(zhì)抗氧化能力。結(jié)論楊梅葉精油產(chǎn)量和品質(zhì)隨季節(jié)而變化, 春夏兩季精油的抗氧化活性差異可能與它們特征組分的相對含量存在顯著差異有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  烏楊梅; 芳香精油; 季節(jié)變化; 抗氧化活性楊梅Myrica rubra Sieb. et Zucc.系楊梅科(Myricaceae)，是原產(chǎn)于中國的亞熱帶樹種，我國有6個種1。楊梅可

3、藥食兩用，宋代食療本草和明代本草綱目對楊梅的藥用功效均有記載。楊梅的枝葉、根、皮在中國大陸、臺灣地區(qū)和日本等地常用作收斂劑、解毒劑和腸胃止瀉劑等傳統(tǒng)中藥成分2。二十多年來，日本和我國學(xué)者對楊梅枝葉溶劑萃取物的藥用成分進(jìn)行過較深入研究，先后分離出楊梅素、單寧、三萜和二芳基庚萜化合物等幾類活性成分36，近年來還分離得到兩種具有抗腫瘤活性的香豆素衍生物等成分7，8。藥理研究表明楊梅葉甲醇萃取物可治療NO、CCl4-和-萘基異硫氰酸酯誘導(dǎo)的肝損傷，50%乙醇萃取物可抑制體內(nèi)黑色素的合成9，10。楊梅屬于芳香植物，近年來相繼開展了針對不同屬楊梅葉芳香精油的分析和生物活性研究。本作者11，12對分布于南嶺

4、自然保護(hù)區(qū)內(nèi)烏楊梅樹不同藥用部位的精油成分及其生物活性也進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的抗氧化和抗食源性致病菌活性，精油特征成分及含量與矮楊梅13、丁岙楊梅14及東魁楊梅15葉部精油存在較大差異。芳香精油的產(chǎn)生與植物的生理和生長環(huán)境條件高度相關(guān), 同種芳香植物因生長環(huán)境的差異，精油含量和品質(zhì)差別顯著，而且在不同季節(jié)、不同生長期、植株的不同部位，精油及其有效成分含量也不同16，17。本文對國內(nèi)南方省份資源豐富的烏楊梅春、夏兩季鮮葉芳香精油進(jìn)行了含量測定，采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)并結(jié)合Kovats保留指數(shù)(KI)對比法對其成分進(jìn)行了比較鑒定，同時通過國際上普遍采用的3種體外評價方法對其抗氧化活性進(jìn)行

5、了對比研究，旨在為客觀評價其藥用價值和保護(hù)性開發(fā)提供科學(xué)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1 材料與儀器1.1 材料烏楊梅M. rubra var.astropurea Tsen.新鮮枝葉由廣東南嶺國家自然保護(hù)區(qū)大頂山管理處分別于2006年4月和7月提供，鮮葉均采自同一顆具有15年樹齡的大樹，采收后速凍處理待用。品種經(jīng)保護(hù)區(qū)彭華貴工程師與該自然保護(hù)區(qū)標(biāo)本庫標(biāo)本對照鑒定。主要試劑包括：C8-C21系列正烷烴(氣相色譜純，中國醫(yī)藥集團(tuán)，上海)，亞油酸(Alfar aesar, 德國)，DPPH自由基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) (Sigma,美國)，AAPH自由基2,2-Azobis(

6、2-methylpropionamidine) dihydrochioride ( Aldrich，美國)，硫代巴比妥酸(Sigma，USA),-胡蘿卜素(Sigma，USA)，2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)和抗壞血酸均為分析純。1.2 儀器芳香精油測定儀(廣州玻璃廠)，氣質(zhì)聯(lián)用儀(Finnigan TRACE /DSQ，美國熱電)，紫外可見分光光度計(jì)(916型，澳大利亞GBC)。2 方法2.1 精油提取與含量測定采用水蒸氣同步蒸餾法提取精油。沸蒸回流3 h。精油用無水硫酸鈉脫水，過濾后取適量正已烷溶解稀釋為1×10-3(V/V)濃度用于氣質(zhì)聯(lián)用分析。樣品測定前均置于-25下貯存。

7、2.2 氣質(zhì)聯(lián)用分析GC-MS分析采用韶關(guān)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心TRACE GC/DSQ 氣質(zhì)聯(lián)用儀完成。GC條件：色譜柱為DB-5石英毛細(xì)管柱，30 m×0.25 mm×0.25 m;載氣為高純氦(99.999%);柱流量1ml·min-1; 不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度220;傳輸線溫度210;進(jìn)樣量1 l。程序升溫，柱溫40(1 min)-10(/min)-200(3 min)。MS條件：電離方式EI，電子能量70 eV，發(fā)射電流100 mA，離子源溫度200，質(zhì)量掃描范圍50-350 m/z，溶劑延遲4 min。C8-C21系列正烷烴均以1×10-3(V/V)濃

8、度用正己烷溶解，與上述GC條件一樣進(jìn)樣測定。楊梅葉精油被GC分離的各成分用下面的線性升溫公式計(jì)算其KI18：KI = 100n + 100( tx-tn )/( tn+1 - tn)其中tx為測定物質(zhì)的保留時間，tn和 tn+1分別為碳原子數(shù)相差為1的正烷烴的保留時間(tn < tx < tn+1)結(jié)果用隨機(jī)所帶的美國NIST Library(2002版)質(zhì)譜庫檢索，并與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)KI值18對比確定，無標(biāo)準(zhǔn)KI值的組分只用質(zhì)譜庫檢索結(jié)果確定。相對含量的確定采用峰面積歸一化法。2.3 抗氧化性評價試驗(yàn)2.3.1 DPPH自由基清除率測定配制濃度分別為4，8，10，16，24，32 和5

9、0 g·L-1的受試樣品甲醇液。分別取200 l與4 ml濃度為6×10-5M DPPH甲醇液混合，于517 nm處測定吸光度，不加樣的DPPH甲醇液為空白樣。平行樣為3個。自由基清除率按下式計(jì)算自由基清除率(%)=(AC(0)AA(t)/ AC(0)×100%其中AC(0)為t = 0 h時的空白樣吸光度值;AA(t)為t= 1 h時樣品吸光度值。2.3.2 -胡蘿卜素漂白試驗(yàn)法將-胡蘿卜素(0.1 mg)用氯仿(10 ml)于梨形瓶中溶解，加入亞油酸(20 mg)和吐溫40(100 mg)，然后于50旋轉(zhuǎn)真空干燥。加入50 ml含氧蒸餾水，于超聲波中形成乳化液

10、A。取200 l濃度分別為4，8，12，16和20 g·L-1的受試樣品乙醇液與5 ml乳化A液于試管中混合，不加樣品的用等量乙醇代替與A液混合作為空白樣。在50保溫，于470 nm測定吸光度。平行樣為3個?？寡趸视孟率接?jì)算抗氧化率(%) = (AA(120) AC(120)/( AC(0) AC(120)× 100%其中AA(120)為t = 120 min時的樣品吸度度，AC(120)為t = 120 min時空白樣吸光度值，AC(0)為t = 0 min時的空白樣吸光度值。2.3.3 硫代巴比妥酸法分別取0.1ml濃度為5，25，50 g·L-1的樣品甲醇

11、液與0.5 ml蛋黃乳濁液混合，加入50 L的AAPH自由基溶液(0.07mol/L)引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。隨后即加入1.5 ml乙酸溶液(20%)和1.5 ml濃度為0.8%硫代巴比妥酸液用1.1% (W/V) 十二烷基硫酸鈉溶液配制，振蕩均勻。不加精油樣品的為空白樣。然后于95水浴保持60 min。冷卻后，每個試管中加入5 ml正丁醇，充分萃取，于1 200 g離心15 min。傾出有機(jī)層在532 nm處測定吸光度值。平行樣為3個。抗氧化指數(shù)用下式計(jì)算抗氧化指數(shù)(%) =(AC(0) AA(t)/ AC(0)× 100%其中AC(0)為空白樣t = 0 h吸光度值，AA(t)為樣品

12、t = 1 h吸光度值。2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS10.0軟件。相同受試濃度水平下各受試物的抗氧化率之間兩兩差異顯著性分析比較用鄧肯氏極差法(P<0.01)。本篇論文由網(wǎng)友投稿，讀書人只給大家提供一個交流平臺，請大家參考，如有版權(quán)問題請聯(lián)系我們盡快處理。3 結(jié)果3.1 精油的GC-MS分析采用水蒸氣同步蒸餾法測得烏楊梅春季鮮葉精油含量為0.13%±0.04% (V/W)、夏季為0.05±0.01%(V/W)。精油均呈檸檬黃色，無刺激性，相對密度為0.9280 mg·ml-1。春、夏兩季烏楊梅葉部精油的氣相色譜總離子流圖如圖1所示

13、。分別對2種精油中相對含量0.05%的41和36種成分進(jìn)行了鑒定，被鑒定的組分相對含量總和分別為相應(yīng)精油的97.30%和99.97%。結(jié)果見表1春、夏兩季楊梅葉部精油的化學(xué)組分基本為倍半萜類(分別為92.77%和97.78%)。春季精油以倍半萜烯含氧衍生物為主(占52.69%)，而夏季精油則主要以倍半萜烯為主(占70.04%)。兩季精油中化學(xué)組成沒有明顯變化，但其主要成分的含量存在較大差異。這種變化主要表現(xiàn)在：夏季精油中的倍半萜烯異石竹烯和石竹烯含量(分別為24.21%和26.47%)比春季精油明顯高得多(分別為10.17%和11.61%)，而大根香葉烯A、-依蘭油烯、-金合歡烯等倍半萜烯成分

14、在兩季節(jié)則變化不大;隨著季節(jié)的更替，5-羥基白菖烯在鮮葉中的含量出現(xiàn)顯著變化，其在春季精油中的含量高達(dá)30.44%，而夏季精油中的含量則僅為1.81%。此外，春、夏兩季精油中均含有較高量的(E)- 橙花叔醇(分別為9.57%和16.65%)。3.2 精油抗氧化性對比分析3.2.1 DPPH自由基清除活性DPPH自由基清除法可適用于親脂性和親水性質(zhì)子供體的活性檢測。本研究選用脂溶性的BHT、弱脂溶性的PG和水溶性的抗壞血酸3個強(qiáng)抗氧化劑為參照，對比了春、夏兩季烏楊梅葉部精油的DPPH自由基清除效果。如圖2所示，BHT、PG和抗壞血酸均表現(xiàn)極強(qiáng)的DPPH自由基清除活性，三者在各受試濃度下的DPPH

15、自由基清除率之間不存在顯著差異(P0.01)。本實(shí)驗(yàn)測定它們的自由基半清除濃度IC50分別為0.014，0.018和0.013 g·L-1?？傮w而言，春、夏兩季烏楊梅葉精油的DPPH自由基清除能力均隨受試濃度升高而增強(qiáng)，春季葉部精油自由基清除活性表現(xiàn)優(yōu)良，其IC50約為0.061 g·L-1，而夏季葉部精油DPPH清除活性較弱，在本實(shí)驗(yàn)條件下未能測出自由基半清除濃度，兩季精油的DPPH自由基清除能力存在顯著性差異(P<0.01)。DPPH自由基是依靠能抗氧化劑提供·H而中和的，作為靈敏的質(zhì)子受體，通過觀察質(zhì)子供體與其反應(yīng)的速度也能判斷受試物抗氧化活性的強(qiáng)弱。

16、在實(shí)驗(yàn)過程中也觀察到，在相同濃度時春季楊梅葉部精油清除自由基的的反應(yīng)速度比夏季精油反應(yīng)速度快得多。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的根本原因可能與5-羥基白菖烯在兩季精油中的含量顯著差異有關(guān)，作者曾測到從春季烏楊梅葉部精油中分離的5-羥基白菖烯單體具有極強(qiáng)的DPPH自由基清除能力12。A-春季樣 B-夏季樣圖1 春、夏兩季楊梅樹葉部精油氣相色譜總離子流圖3.2.2 -胡蘿卜素漂白抑制活性-胡蘿卜素漂白試驗(yàn)法主要評價的是抗氧化物質(zhì)在乳化脂質(zhì)體系中抑制脂質(zhì)氫過氧化前期反應(yīng)的能力。圖3為采用-胡蘿卜素漂白試驗(yàn)法測定的烏楊梅葉部精油與抗氧化劑BHT、PG和抗壞血酸的抗氧化效果對比。在脂質(zhì)體系中醇溶性的BHT是公認(rèn)的強(qiáng)抗氧

17、化劑，在本試驗(yàn)條件下，BHT再現(xiàn)出極強(qiáng)的抗氧化性，其半抑制濃度IC50約為0.083 g·L-1。值得一提的是作為強(qiáng)抗氧化劑的水溶性抗壞血酸幾乎不顯現(xiàn)其抗氧化活性，而且與濃度無相關(guān)性，弱水溶性的PG也未能測出其IC50值，與BHT存在極為顯著的差異(P<0.01)。這種現(xiàn)象稱為脂質(zhì)體系中的“極性反?！?Polar paradox)，已被許多研究者所證實(shí)19，其原因是由于水溶性極性物質(zhì)在乳化脂質(zhì)體系中主要集中在水相，而脂相中的濃度極低。春、夏兩季楊梅葉部精油在高濃度時也表現(xiàn)出較好的抑制-胡蘿卜素漂白的活性，它們的IC50分別約為0.177和0.264 g·L-1，不存在

18、顯著性差異(P0.01)。表明它們抑制脂質(zhì)氫過氧化前期的能力相近，呈現(xiàn)抗氧化能力的成分主要是脂溶性成分，即春季精油中高含量的5-羥基白菖烯、異石竹烯和石竹烯等特征成分，以及夏季精油中高含量的異石竹烯和石竹烯等特征成分是主要的脂質(zhì)抗氧化物質(zhì)。3.2.3 硫代巴比妥酸法脂質(zhì)抗氧化指數(shù)硫代巴比妥酸法主要衡量的是抗氧化劑清除能導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的自由基的能力，但同時也能衡量弱親脂性抗氧化劑的抗氧化能力。如表2所示，樣品的抗氧化指數(shù)均隨受試濃度的升高而上升，但有些抗氧化劑在同一受試濃度的抗氧化指數(shù)之間的差異極為顯著(P<0.01)。采用該法對極性較大的抗氧化劑PG和抗壞血酸進(jìn)行測試的結(jié)果與-胡蘿卜素漂

19、白試驗(yàn)法一樣，PG、抗壞血酸與BHT的抗氧化指數(shù)存在極為顯著的差異(P<0.01)，也表現(xiàn)出“極性反?！爆F(xiàn)象。春季楊梅葉部精油在受試濃度下與BHT的抗脂質(zhì)過氧化能力不存在極為顯著的差異，尤其是在高濃度下的抗氧化能力接近BHT，而夏季楊梅葉部精油與BHT的抗氧化能力差異顯著。春夏兩季楊梅葉部精油之間的抗脂質(zhì)過氧化能力也存在差異，這可能與其化學(xué)組成特征成分的含量差異有關(guān)。表1 春、夏兩季楊梅樹葉部精油對比鑒定的成分及其相對含量4 結(jié)論春、夏兩季烏楊梅葉部精油中化學(xué)組成沒有明顯變化，但精油的產(chǎn)量和組分的相對含量存在顯著差異。春季烏楊梅葉部精油成分以倍半萜烯含氧衍生物為主，其中5-羥基白菖烯是最

20、主要的特征成分;而夏季精油則以倍半萜烯為主，其中異石竹烯和石竹烯是最主要的特征成分。表明楊梅葉部精油產(chǎn)量和品質(zhì)隨季節(jié)而變化?？傮w上春季葉部精油的抗氧化活性明顯優(yōu)于夏季葉部精油。春季精油具有較好的DPPH自由基清除能力，在脂質(zhì)體系氧化前期與后期均表現(xiàn)優(yōu)越的抗氧化能力;夏季葉部精油的DPPH自由基清除能力較弱，但表現(xiàn)出一定的脂質(zhì)抗氧化能力。春、夏兩季烏楊梅葉部精油的抗氧化能力的差異可能與其特征組分相對含量存在顯著差異有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 李興軍,呂均良,李三立.中國楊梅研究進(jìn)展J. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999, 17(2):224.2 Matsuda H, Morikawa T, a

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