卵母細(xì)胞和胚胎玻璃化冷凍方法

1、卵母細(xì)胞和胚胎玻璃化解凍方法用途：本品用于卵母細(xì)胞和胚胎的玻璃化解凍配套。安全解凍配套：1. 1瓶4ml解凍液（TS）2. 1瓶1.5ml稀釋液(DS)3. 1瓶1.5ml 沖洗液(WS)4. 1個(gè)25mm 的培養(yǎng)皿(用于解凍液)5. 1個(gè)6孔生殖板使用說明準(zhǔn)備：*用載體和生殖板將解凍液放到37的培養(yǎng)箱里加溫將所有解凍液倒入生殖板里。*用微細(xì)管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放進(jìn)培養(yǎng)皿。注意：用巴斯德管吸取一個(gè)大小合適的卵母細(xì)胞（直徑：140um）或者胚胎(直徑：140-180um)解凍：1. 迅速地將載體頂放進(jìn)解凍液中，浸泡1分鐘。（圖一）2. 用巴斯德管吸取卵母細(xì)胞（胚胎），輕輕地將

2、其放入DS底部，浸泡3分鐘。（圖二）3. 用巴斯德管吸起卵母細(xì)胞（胚胎），輕輕地將其放入WS1 底部，浸泡5分鐘。（圖三）4. 用巴斯德管吸起卵母細(xì)胞（胚胎），輕輕地將其放入WS2 頂部，當(dāng)卵母細(xì)胞（胚胎）自動(dòng)沉到底部的時(shí)候，重新再重復(fù)這一步驟。（圖四）5. 將卵母細(xì)胞（胚胎）轉(zhuǎn)移到裝有合適培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。放進(jìn)37的培養(yǎng)箱中完成恢復(fù)。注意：卵母細(xì)胞要放置2小時(shí)，胚胎則要3小時(shí)。質(zhì)量控制測(cè)試：每一批安全解凍配套都得到以下測(cè)試：*溶液：UPS不孕不育無菌測(cè)試（SAL 10-3） LAL拉爾內(nèi)毒素測(cè)試 小老鼠胚胎試驗(yàn)（一個(gè)細(xì)胞）保存方法：*保存于4-8*在標(biāo)簽所示有效日期前，本品性質(zhì)穩(wěn)定。成分：*

3、血清替代補(bǔ)充*基本培養(yǎng)基M-199 內(nèi)含的HEPES*蔗糖參考文件（此部分請(qǐng)看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0 基礎(chǔ)液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母細(xì)胞玻璃化冷凍)No.1 稀釋液（ES）: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2*冷凍管x4, 建議每個(gè)冷凍管最多儲(chǔ)存3個(gè)卵母細(xì)胞或者3個(gè)胚胎*復(fù)制板x2: 6孔*冷卻架(藍(lán)盒液氮，型號(hào)：VT-CLB)*巴斯德管（型號(hào)：MT-150）*顯微鏡（關(guān)掉加熱板）*秒表或計(jì)算器（帶計(jì)算功能）*液氮（消毒過濾功能，聚四氟乙烯濾膜過濾）*鑷子*顯微針x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*

4、儲(chǔ)存罐注意：使用的巴斯德管大小要與卵母細(xì)胞或胚胎大小合適。（卵母細(xì)胞內(nèi)直徑：140um，胚胎內(nèi)直徑：140-200um），盡量減少與玻璃解凍液的接觸以提高解凍后的成活率。平衡這個(gè)步驟，卵母細(xì)胞與胚胎步驟不一樣。第二部分 玻璃化準(zhǔn)備1. 將BS、ES和VS放到室溫25-27。2. 在管上寫上客戶信息3. 冷卻架要添加液氮至90%4. 將裝有卵母細(xì)胞或者胚胎的培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，用巴斯德管取出卵母細(xì)胞或者胚胎在顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞或胚胎的質(zhì)量狀況。比較卵黃周隙與透明帶的寬度，并做記錄,這樣更容易知道在ES浸泡后完成平衡液步驟。卵黃周隙透明帶注意：如果用的是卵母細(xì)胞則要將積云細(xì)胞出去。 第三部分

5、平衡卵母細(xì)胞平衡1在復(fù)制板邊上分別寫上BS, VS1和VS2.用巴斯德管取出20ul的BS，300ul VS1和300ul VS2,放進(jìn)復(fù)制板里（看下圖）。卵母細(xì)胞平衡2用巴斯德管取出卵母細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到BS（20ul）溶液底部。卵母細(xì)胞平衡3 (3分鐘)調(diào)整秒表（有計(jì)算功能），為以下步驟檢查并設(shè)定好秒表。沿著復(fù)制板孔的邊緣移動(dòng)巴斯德管，輕輕地將20ul ES增加到有卵母細(xì)胞BS溶液的頂部，放置3分鐘。 卵母細(xì)胞平衡4 (3分鐘)仿照上個(gè)步驟再增加20ul ES溶液到頂部，放置3分鐘。 卵母細(xì)胞平衡5 (9分鐘)仿照上個(gè)步驟再增加240ul ES溶液到頂部，放置9分鐘。在平衡液這個(gè)部分，卵母細(xì)

6、胞大小要完全恢復(fù)，在卵母細(xì)胞在ES浸泡前，卵黃周隙寬度平均的時(shí)候，這個(gè)部分就完成了。 玻璃化配套胚胎平衡胚胎-平衡1在復(fù)制板邊上分別寫上ES, VS1和VS2.將 將ES和兩瓶VS充分混合。用巴斯德管分別取出300ul 溶液，立刻放進(jìn)復(fù)制板里（看右圖）。胚胎-平衡2用巴斯德管吸取胚胎于巴斯德管頂部，看右圖。然后將胚胎放到ES中頂部。胚胎-平衡3 （12到15分鐘）調(diào)整秒表（有計(jì)算功能），為以下步驟檢查并設(shè)定好秒表。胚胎于30秒內(nèi)自由脫落，它會(huì)自發(fā)地開始收縮，在ES滲透后，胚胎就會(huì)逐漸恢復(fù)到原來的大小，此時(shí)平衡步驟就完成了。注意：胚泡平衡要等待卵黃周隙消失。胚泡玻璃化解凍最好的時(shí)候是胚胎直徑達(dá)到

7、140-180ul的時(shí)候。胚胎平衡的時(shí)間取決于胚胎的大小和質(zhì)量，好的胚胎和小的胚胎所需時(shí)間就比較少。舉例來說，一個(gè)好的胚胎8分鐘完全恢復(fù)，平衡步驟已經(jīng)完成。如果不能確定胚胎是否完全恢復(fù)，則停止平衡，12分鐘進(jìn)行原核細(xì)胞分裂， 15分鐘進(jìn)入桑椹胚和囊胚階段，這樣就足夠了。第四部分 玻璃化這個(gè)部分對(duì)于卵母細(xì)胞和胚胎都是一樣的，以下1到7步驟應(yīng)在60-90秒內(nèi)完成。玻璃化 1從ES溶液中用巴斯德管頂吸出卵母細(xì)胞（胚胎），看右圖。然后將胚胎（胚胎）放到VS1中頂部,盡量減少攜帶ES溶液。僅將卵母細(xì)胞（胚胎）帶進(jìn)VS1，為了避免將ES帶進(jìn)VS1，首先將ES吹到孔的外邊，將新鮮的VS1吹到孔的外面，用VS

8、1吸入巴斯德管內(nèi)。玻璃化21分鐘內(nèi)用巴斯德管吸入卵母細(xì)胞（胚胎）并放入VS1，在卵母細(xì)胞（胚胎）周圍快速地?cái)嚢?次。重新吸入卵母細(xì)胞（胚胎），在另外的位置放下VS1，在其周圍快速地?cái)嚢?次。改變卵母細(xì)胞（胚胎）周圍的VS1溶液，直到ES溶液視覺上消失了。玻璃化30.5分鐘將巴斯德管內(nèi)的VS1溶液吹到孔外，將VS2溶液吸入巴斯德管，然后從VS1溶液中將卵母細(xì)胞（胚胎）吸入巴斯德管。將其放入VS2中，盡量減少帶入VS1。在卵母細(xì)胞（胚胎）周圍快速地?cái)噭?dòng)，變換2次位置，請(qǐng)看上圖。當(dāng)卵母細(xì)胞（胚胎）周圍全被VS溶液包圍并能觀察到卵母細(xì)胞（胚胎）表面因脫水而萎縮時(shí)，此步驟即完成。玻璃化4將載體放在顯微鏡

9、下觀察（標(biāo)簽要朝上），調(diào)整將重點(diǎn)放在載體黑色標(biāo)志上面。看下圖。玻璃化4將載體放在顯微鏡下觀察（標(biāo)簽要朝上），調(diào)整將重點(diǎn)放在載體黑色標(biāo)志上面。看下圖。玻璃化5用巴斯德管從VS2吸取收縮了的卵母細(xì)胞（胚胎），將卵母細(xì)胞（胚胎）放在載體的黑體位置，盡量減少帶入VS2(少于1ul), 如果超過2個(gè)卵母細(xì)胞（胚胎），每個(gè)卵母細(xì)胞（胚胎）要1滴。看右圖。在載體上除去VS將卵母細(xì)胞放在載體后，用吸液管將多余的VS液體吸去。將吸液管頂部放在VS液底部將吸液管橫向拉開液體，使VS液體降低吸取多余的VS液，盡量減少VS留下，但不能吸去卵母細(xì)胞（胚胎）好樣板不好的樣板在載體黑色部分有1滴平面VS液體，在載體黑色旁邊

10、有立體的VS液滴，VS2太多玻璃化6在顯微鏡下觀察載體上的卵母細(xì)胞（胚胎）是否會(huì)有太多的VS液體，快速地將載體放入液氮中。玻璃化7用鑷子夾住管帽，將載體尾端插入液氮中，然后用帽蓋將載體擰緊。用鑷子夾住管帽，將載體插入用手拿著管帽，套好擰緊管帽，確定管帽扣緊載體玻璃化8檢查管帽是否擰緊，將載體放入罐子里然后放入儲(chǔ)存罐注意：載體紙要一直放在液氮中，直到將其放入儲(chǔ)存罐中，當(dāng)有需要將載體轉(zhuǎn)移到其他儲(chǔ)存罐時(shí)，其中的時(shí)間要將載體放在液氮中，在解凍之前不能將載體暴露在空氣中。解凍*第一部分 需要材料玻璃化解凍配套No.1 解凍液（TS）:1x4mlNo.2 稀釋液（DS）:1x1.5mlNo.3 沖洗液（W

11、S）:1x1.5mlNo.4 培養(yǎng)皿：TS用35mmNo.5 復(fù)制板：6孔*冷卻架(藍(lán)盒液氮，型號(hào)：VT-CLB)*巴斯德管（型號(hào)：MT-150）*顯微鏡（關(guān)掉加熱板）*秒表或計(jì)算器（帶計(jì)算功能）*液氮（消毒過濾功能，聚四氟乙烯濾膜過濾）*鑷子*顯微針: 100-1000 ul*罐子*儲(chǔ)存罐注意：使用的巴斯德管大小要與卵母細(xì)胞或胚胎大小合適。（卵母細(xì)胞內(nèi)直徑：140um，胚胎內(nèi)直徑：140-200um），盡量減少與玻璃解凍液的接觸以提高解凍后的成活率。第二部分 解凍準(zhǔn)備1. 用培養(yǎng)皿裝TS（密封）放進(jìn)培養(yǎng)箱37回暖（大于1.5小時(shí)）2. 將DS,WS置于室溫內(nèi)（25-27）3. 取回裝有載體的

12、罐子，快速地將罐子插入裝滿液氮的冷卻架中。取回冷卻架的罐子，檢查載體上標(biāo)注的病人信息。注意：用體視顯微鏡放置好冷卻架3. 在復(fù)制板邊上分別寫上DS, WS1和WS2. 將1瓶DS和兩瓶WS充分混合。用巴斯德管分別取出300ul 溶液，立刻放進(jìn)復(fù)制板里（看右圖）。將復(fù)制板放在顯微鏡下觀察。從培養(yǎng)箱取出TS溶液和培養(yǎng)皿，反轉(zhuǎn)TS兩次，使溶液均勻后將全部倒入培養(yǎng)皿中。4.將顯微鏡重點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)裝有TS的培養(yǎng)皿，用巴斯德管確定顯微鏡對(duì)準(zhǔn)培養(yǎng)皿正中間。.解凍第三部分 解凍解凍1輕輕地?cái)Q開和除去在液氮中的載體管帽，豎立在冷卻架的邊角。解凍2準(zhǔn)備好用巴斯德管將載體固定在液氮中，設(shè)置好秒表（有計(jì)算功能）。為以下步驟

13、檢查并設(shè)定好秒表。解凍3快速地將載體放入在顯微鏡下的TS，時(shí)間應(yīng)為1秒鐘（看左下圖）。卵母細(xì)胞（胚胎）要在載體黑色部分中間。泡在TS 1分鐘，卵母細(xì)胞（胚胎）與載體紙分離后，輕輕地用巴斯德管吸取卵母細(xì)胞（胚胎），就算卵母細(xì)胞（胚胎）沒與載體分離也要將其吸入巴斯德管。同樣，吸取TS液，知道卵母細(xì)胞（胚胎）達(dá)到巴斯德管頂2mm.第四部分 稀釋稀釋3分鐘慢慢地從巴斯德管將TS液放入DS液 底部，然后慢慢地將卵母細(xì)胞（胚胎）放到DS液 的TS底層。放置3分鐘，這個(gè)步驟是將卵母細(xì)胞（胚胎）從TS逐漸轉(zhuǎn)移到DS液中。 第五部分 沖洗沖洗1需時(shí)5分鐘浸泡在DS液中3分鐘后，用巴斯德管從DS液中輕輕地吸取卵母細(xì)胞（胚胎），同時(shí)，吸入DS液，直到卵母細(xì)胞（胚胎）離巴斯德管頂2mm。 首先只將巴斯德管里的DS液放入在WS1 底部，然后輕輕地將卵母細(xì)胞（胚胎）放入到WS1底部的DS層里。這個(gè)步驟主要是將卵母細(xì)胞（